泰諾福韋特戊酸酯抗鴨乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究

王成麗戴國俊陶建平邢 華謝愷舟

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

泰諾福韋特戊酸酯抗鴨乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究

王成麗1戴國俊2陶建平2邢 華2謝愷舟2

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

為了研究泰諾福韋特戊酸酯（PMPA）治療鴨乙型肝炎的療效。試驗(yàn)以無乙型肝炎病毒（DHBV）的雛鴨為陰性對照組，將人工感染DHBV的雛鴨隨機(jī)分成5組，其中2組分別為陽性和陽性藥物藥物拉米夫?qū)φ战M，其余3組為不同劑量的PMPA治療組。用PCR方法檢測血清中的鴨乙型肝炎病毒，ELISA法檢測血清中DHBV的OD值以及甲胎蛋白濃度。研究成功構(gòu)建了DHBV陽性模型，用藥后第2和第3周，PMPA中劑量治療組OD值極顯著低于陽性對照組（P＜0.01），且用藥后第2周中劑量組OD值下降，但仍顯著高于陽性藥物拉米夫定組（P＜0.05）；經(jīng)PMPA治療后，陽性鴨DHBV個體全部轉(zhuǎn)為陰性，但停藥后均有不同程度的反彈。結(jié)果表明泰諾福韋特戊酸酯對DHBV具有一定的抑制作用和療效。

泰諾福韋特戊酸酯 鴨乙型肝炎病毒 治療效果

乙型肝炎是危害人類健康主要疾病之一，全世界約有3億人感染乙肝病毒（HBV），而中國就約有1.2億人[1]，所以乙型肝炎患者及帶毒者數(shù)量龐大，其患者還面臨發(fā)展為肝硬化和肝癌的危險。乙型肝炎病毒的復(fù)制是慢性乙型肝炎病情反復(fù)難以治愈的重要原因[2]。到目前為止，乙型肝炎的治療還沒有特效藥物。預(yù)防和治療乙型肝炎的主要手段仍是使用疫苗免疫或化學(xué)藥物。我國用于治療人類乙型肝炎的藥物大多依靠進(jìn)口，目前尚無療效顯著的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)藥在臨床上應(yīng)用。要解決我國千百萬慢性肝炎病人的治療問題，迫切需要創(chuàng)制更好的新藥。尋找更有效的治療途徑是醫(yī)學(xué)研究的重要課題[3-5]。泰諾福韋特戊酸酯是一種無環(huán)核苷衍生物磷酸鹽類似物樣的藥物，它屬于核苷類似物。核苷類似物有逆轉(zhuǎn)錄酶功能，具有促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和加快更新速度的作用，能夠終止乙型肝炎病毒DNA鏈的延伸，從而達(dá)到抑制其繁殖的目的。為了研究泰諾福韋特戊酸酯在治療乙型肝炎的作用。本實(shí)驗(yàn)通過泰諾福韋特戊酸酯在鴨乙型肝炎模型動物[6]體內(nèi)給藥試驗(yàn)，研究其抗鴨乙型肝炎病毒的效果，為該藥物的藥效學(xué)評價和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 DHBV陽性模型動物（鴨）的制備 采集DHBV為陽性的成年高郵麻鴨的血樣，經(jīng)離心后，取上層血清為毒種，添加100 IU/ml青霉素冷凍保存?zhèn)溆谩?日齡DHBV陰性櫻桃谷肉鴨雛鴨48只，按櫻桃谷肉鴨常規(guī)飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)。其中40只分別于1日齡和10日齡經(jīng)足靜脈注射DHBV陽性血清（接種DHBV種毒），陰性對照組鴨8只注射等量生理鹽水，注射量為0.2ml/次/只。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 泰諾福韋特戊酸酯，蘇州博瑞生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供，批號：BP0018；陽性對照藥物：拉米夫定（LAM），葛蘭史克制藥有限公司生產(chǎn)，批號：0412009。

1.1.3 主要檢測試劑及檢測方法 DHBV基因組 PCR檢測試劑，由上海生物工程公司生產(chǎn)；血清甲胎蛋白（AFP）檢測ELISA試劑盒，由農(nóng)業(yè)部青島動物檢驗(yàn)檢疫所提供；MBST（0.01M，pH7.4）、OPD底物溶液和H2SO4（2M），PBST溶液由本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2 動物分組與給藥方法

1.2.1 動物分組 試驗(yàn)分6組，每組8只。陰性對照組為灌服pH 2.5的檸檬酸水的DHBV陰性鴨；陽性對照組為灌服pH2.5的檸檬酸水的DHBV陽性鴨；陽性藥物組為灌服濃度10mg/ml的LAM DHBV陽性鴨；PMPA低劑量、中劑量和高劑量組分別為灌服濃度3.75mg/ml、7.5mg/ml和15mg/ml的PMPA DHBV陽性鴨。

1.2.2 藥物配置 先用90%的酒精作為溶劑溶解PMPA，總?cè)芤毫繛槊刻煊昧康?0%，待充分溶解后加入pH為2.5的檸檬酸鈉，配成終濃度15mg/ml的PMPA溶液，即高劑量組濃度，再以pH為2.5的檸檬酸鈉按1：2和1：4稀釋成終濃度分別為7.5mg/ml和3.75mg/ml的中、低劑量組。終濃度為10mg/ml的拉米夫定也用PH為2.5的檸檬酸溶液配制。所有藥物均每天現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 給藥時間、劑量與藥物抑制效果評價指標(biāo)測定時間 一月齡時開始給藥，連續(xù)給藥3周，給藥期間，每天上午測定各個體體重，試驗(yàn)組各個體按每天、灌服藥物劑量均為2ml（2ml/kg·d）。并分別于用藥前，用藥后1周、2周、3周（停藥）和停藥后1周稱重，采集血樣，分離血清，檢測實(shí)驗(yàn)藥物對DHBV的抑制效果相關(guān)評價指標(biāo)。

1.3 DHBV

藥物抑制效果評價指標(biāo)及測定方法

1.3.1 體重 每次體重測定均是早上8：00空腹稱重。

1.3.2 PCR檢測方法 根據(jù)陽性鴨DHBV的序列設(shè)計引物，上游引物（C1）為5'-ATG CCC CAA CCA TTG AAG CA-3'，下游引物（C2）為5'-CGG CCT GCT AAT TGA TTT AG-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物長度為711bp。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.5μl，C1 0.3μl，C2 0.3μl，dNTP 2.5μl，TeqE 0.3μl，模板1.0μl，加無菌雙蒸水至25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共34個循環(huán)，72℃ 7 min，4℃ pause。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNA marker鑒定片段大小，同時設(shè)陽性對照和陰性血清對照。陽性條帶在711bp處。

1.3.3 甲胎蛋白ELISA檢測方法 按試劑盒操作說明，將待測樣品用0.01M PBS（pH7.4）作1：100稀釋。取出凍存的酶標(biāo)板至室溫，用PBST洗一次，拍干。加入1：100稀釋的待測樣品，100μl/孔。每板設(shè)陽性對照一孔（加入已配好的陽性對照100μl）。每板設(shè)陰性對照2孔（選用健康雞血清，用0.01M PBS作1：100稀釋后，每孔加樣100μl）。37℃水浴作用2h，PBST洗板3次。用0.01M PBS（pH7.4）按1：2000稀釋酶標(biāo)抗體，100 μl/孔。37℃水浴作用2h，PBST洗板3次。加入OPD底物溶液（100μl/孔）37℃避光顯色10min，2M H2SO4（100μl）終止反應(yīng)，測定OD490值。判斷。陽性對照顯色，陰性對照血清不顯色。分別計算N值（兩孔陰性對照的平均OD490值）和P值（待測血清樣品的OD490值），P/N≥2.1判為陽性，反之判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 泰諾福韋特戊酸酯對DHBV鴨不同周齡體重的影響

泰諾福韋特戊酸酯對DHBV鴨不同用藥階段（周齡）體重的影響結(jié)果見表1。由表中數(shù)據(jù)可見，各組體重都呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，陰性對照組增重最快，陽性對照組和陽性藥物組（拉米夫定組）增重平緩，陰性對照組、陽性對照組和各治療組間差異不顯著，陽性藥物組與PMPA各組間差異也不明顯，經(jīng)統(tǒng)計分析不同階段各組間增重差異均不顯著（P＞0.05），所以體重不是用于評定藥物抑制效果的最佳指標(biāo)。

表1 不同處理組各階段體重測定結(jié)果

2.2 泰諾福韋特戊酸酯對DHBV抑制效果的ELISA檢測結(jié)果

由表2各組實(shí)驗(yàn)動物不同階段血清中DHBV用ELISA法檢測的OD值可見，用藥前無論陽性組、陽性藥物組和PMPA治療組間比較差異均不顯著（P＞0.05），而這些組與陰性對照組差異極顯著（P<0.01）。用藥后的不同時間測定點(diǎn)，陰性對照組的OD值也均極顯著低于其他各組（P<0.01）。用藥后第1周，除陰性組外其他各組間比較差異也不顯著（P＞0.05）。用藥后第2和第3周，PMPA中劑量治療組均極顯著低于陽性對照組（P<0.01），且用藥后第2周中劑量組OD值下降，但仍顯著高于陽性藥物拉米夫定組（P<0.05），直到第3周時中劑量組OD值下降到和陽性藥物組比較差異不顯著（P＞0.05）。由停藥后1周各組比較可見，只有陽性藥物組的OD值顯著低于陽性組（P<0.05），而PMPA各治療組與陽性組比較差異不顯著（P＞0.05），說明停藥后藥物作用消失，OD值上升。由表還可以發(fā)現(xiàn)，藥物治療組在用藥的第1周OD值均有不同幅度的下降，但陽性藥物組和PMPA藥物高劑量組OD值下降速度最快，從用藥后的第2周開始逐漸升高，其中陽性藥物組升高幅度小于PMPA各治療組。

表2 各組動物實(shí)驗(yàn)各階段血清樣品DHBV的ELISA檢測結(jié)果（OD值）

2.3 泰諾福韋特戊酸酯對DHBV抑制效果的PCR檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動物血清的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖2.3。各組實(shí)驗(yàn)動物試驗(yàn)各階段，血清中DHBV用PCR方法檢測出的陽性數(shù)見表3。

由表3可見，陰性對照組用藥前后各階段陽性率均為0.00%，陽性對照組陽性率均為100%，沒有變化。而陽性藥物組和PMPA藥物低、中和高劑量組的陽性率在用藥后的第1和第2周均下降為0.00%，但陽性藥物組在用藥后第3周有2個個體轉(zhuǎn)為陽性，而待測藥物各劑量組均在停藥后第3d開始有部分個體轉(zhuǎn)為陽性，且低劑量組和高劑量組在停藥1周后反彈較為明顯。就轉(zhuǎn)陽率而言，PMPA比拉米夫定陽性藥物對照組的效果好。

2.4 泰諾福韋特戊酸酯對血清中甲胎蛋白（AFP）的影響檢測結(jié)果

由表4結(jié)果可見，用藥前，除陰性組AFP濃度極顯著地高于其他各組外（P<0.01），而陽性組、陽性藥物組和PMPA各治療組的AFP濃度差異不顯著（P＞0.05）。陰性和陽性對照組的AFP濃度，隨著用藥后時間的推移，總體上略呈下降趨勢，但下降速度不及陽性和PMPA藥物組，其中PMPA高劑量組的AFP下降的速度最快，說明用藥量會直接影響AFP的濃度。由表還可見，停藥后1周各用藥組（含陽性藥物組）間比較差異不顯著（P＞0.05）。但極顯著高于陰性對照組，低于陽性組（P<0.01）。

3 討論

3.1 鴨和人慢性乙型肝炎的相關(guān)性以及模型動物選擇與藥物治療

慢性乙型肝炎是消化系統(tǒng)常見的一類傳染性疾病，患者多通過血液、性傳播等方式感染乙型肝炎病毒，進(jìn)而引起肝的變性、壞死[7]。由于目前乙型肝炎病毒僅能在黑猩猩等數(shù)量較少而價格昂貴的靈長類動物體內(nèi)繁殖，難以建立和應(yīng)用人類HBV動物模型[8]。周翊鐘等（1980）在飼養(yǎng)2年以上鴨的血清中發(fā)現(xiàn)與鴨肝炎和肝癌相關(guān)的病毒[9]。同年Summers等[10]曾在來自中國啟東的33份鴨血清中發(fā)現(xiàn)11份有類似人HBV的病毒。Mason等在美國的北京鴨血清中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性DNA多聚酶活性的DNA病毒，且大量病毒DNA存在于肝臟，其生物學(xué)特性與HBV相似[11]，命名為鴨乙型肝炎病毒，為乙肝病毒感染的研究提供了理想的動物模型[12]。

表3 各組動物實(shí)驗(yàn)多階段血清樣品DHBV的PCR檢測結(jié)果

表4 各組動物各階段AFP濃度測定結(jié)果

建立鴨乙型肝炎動物模型需要選擇合適的鴨種，Mason等（1980）研究選擇DHBV自然感染率較低的櫻桃谷鴨作為鴨乙肝動物模型的鴨種，用同樣劑量對1日齡櫻桃谷鴨和北京鴨實(shí)驗(yàn)感染，櫻桃谷鴨兩周后有12/13只出現(xiàn)病毒血癥，而北京鴨血清DHBV陽轉(zhuǎn)時間不一，并認(rèn)為櫻桃谷鴨更適合作為肝炎動物模型[13]。Cooper[14]等應(yīng)用原代鴨肝細(xì)胞觀察感染早期 DHBV 進(jìn)入細(xì)胞的步驟。Kundgen等[15]發(fā)現(xiàn)在垂直感染的鴨卵內(nèi)，8日齡鴨胚可檢測到成熟的 DHBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。唐霓等[16]用不同日齡鴨接種 DHBV 建立急性和慢性感染，發(fā)現(xiàn)慢性感染的形成與幼鴨免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善有關(guān)，不同鴨齡的肝細(xì)胞對 DHBV易感性不同。

本試驗(yàn)在雛鴨1日齡時就進(jìn)行DHBV的感染，10日齡再感染1次，制作為模型動物。盡管雛鴨對DHBV非常易感，但選擇適當(dāng)保存的較高DHBV滴度的鴨血清作為毒種對成功感染尤為重要。而且，不同來源的DHBV陽性血清的感染力也存在一定的差異，因此毒種要求來源專一，最好是同一批次的陽性血清。雛鴨實(shí)驗(yàn)感染途徑很多，以DHBV陽性鴨血清靜脈、腹腔、肌肉、皮下和肝內(nèi)注射13日齡雛鴨均可使之感染。但以靜脈感染和腹腔感染最為常用，其中靜脈感染多取鴨頸靜脈，1～3日齡雛鴨因其免疫系統(tǒng)尚未完善，容易形成免疫耐受，病毒血癥可持續(xù)3個月以上。

目前國內(nèi)治療乙型肝炎的藥物主要可分為三類：抗病毒藥、改善肝功能藥以及免疫調(diào)節(jié)藥?？共《舅幹饕懈蓴_素和核苷類似物。該類藥物治療效果較好，但價格昂貴且停藥后易復(fù)發(fā)。改善肝功能藥又稱保肝藥或抗肝細(xì)胞損傷藥，如聯(lián)苯雙酯、肝細(xì)胞生長因子、甘草酸，水飛薊素及某些中草藥制劑等。改善肝功能藥對降酶、改善癥狀有一定效果，且費(fèi)用較低，副反應(yīng)少，但停止使用后，大多數(shù)病人病情亦會復(fù)發(fā)，且對肝炎病毒陽性指標(biāo)轉(zhuǎn)陰療效較差。免疫調(diào)節(jié)藥有胸腺素、白細(xì)胞介素-2、轉(zhuǎn)移因子等。這類藥物治療慢性肝炎的病例不多，療效尚待肯定，藥費(fèi)較昂貴，且有副反應(yīng)[13]。由此可見，目前尚無滿意的治療慢性肝炎藥物，要解決我國千百萬慢性肝炎病人的治療問題，迫切需要創(chuàng)制更好的新藥。肝炎由病毒引起，要徹底治愈肝炎，關(guān)鍵還是尋找有效的抗肝炎病毒藥。本實(shí)驗(yàn)用對乙型肝炎病毒有明顯抑制作用的核苷酸類似物拉米夫定作為陽性藥物對照，通過與泰諾福韋特戊酸酯不同劑量組對DHBV的抑制作用的比較，研究該藥物的治療效果。

3.2 DHBV感染程度的檢測指標(biāo)和評價

AFP是胎兒發(fā)育過程中，由卵黃囊和胎兒肝產(chǎn)生，妊娠13周時，胎兒血液中含量達(dá)最高峰，約3×106μg/L，周歲后嬰兒血液中AFP濃度接近成人，一般健康成人AFP濃度低于20μg/L[17]。原發(fā)性肝癌的患者，其惡變的肝細(xì)胞有恢復(fù)合成AFP的能力，而致血液中AFP濃度升高，且常>400μg/L[18]。AFP在非腫瘤性肝病時也可出現(xiàn)升高，其機(jī)制尚不十分清楚，可能是細(xì)胞炎性病變壞死后，繼而又增生而導(dǎo)致異常分泌的結(jié)果[13]。在鴨動物模型的血清中從檢測的AFP可以看出在用藥后呈明顯下降。

PCR陽性數(shù)和OD值的大小在一定程度上說明了藥物的治療效果。研究表明待測藥物低、中劑量組在用藥開始時各項(xiàng)監(jiān)測指標(biāo)下降不明顯，在用藥兩周后依然能使OD值比用藥前有所下降，至停藥后才有所上升；而高劑量組用藥一周后OD值極顯著下降，但第二周就開始反彈，甚至達(dá)到用藥前水平。這說明本藥物對DHBV有一定的抑制作用，每日給予一定劑量的藥物能抑制病毒的復(fù)制，從而達(dá)到控制及治療乙肝的目的，但過高劑量服用該藥物雖然在短期內(nèi)有顯著的療效，但長期療效不如低、中劑量組，且低劑量組對病毒的抑制效果不如中劑量組。由此可見，該藥物的長期抗病毒效果與其服用的劑量大小有一定的關(guān)系。研究還表明，藥物使用與否對鴨的生長沒有顯著的影響。各劑量組與拉米夫定組同時間點(diǎn)的病毒抑制率比較無顯著差異，說明該藥與拉米夫定有相近的體內(nèi)抗鴨肝炎病毒作用。在停藥后所有的劑量組各指標(biāo)均有所反彈，這可能與其抑制病毒復(fù)制的機(jī)理有關(guān)，藥物能抑制病毒DNA逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，使病毒的DNA鏈的延伸被阻斷，但不能完全將病毒從體內(nèi)清除，因而停藥后病毒復(fù)制仍可恢復(fù)，故OD值和PCR陽性數(shù)都在停藥后有所上升，這也是許多核苷類藥物的缺陷，可在以后的用藥過程中采取聯(lián)合用藥或終生用藥的方法將其克服，但該藥長期服用的毒理作用尚待進(jìn)一步研究。

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江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項(xiàng)目（PPZY2015C230）

王成麗（1978-），女，江蘇泰州人，碩士。

邢 華