鏈霉菌DrrAB外排系統(tǒng)的研究進展

馮振月，劉德福，劉 碩，王麗姿，崔玉東

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鏈霉菌DrrAB外排系統(tǒng)的研究進展

馮振月1，劉德福2，劉 碩1，王麗姿1，崔玉東1

鏈霉菌產(chǎn)生兩類重要的抗腫瘤藥物阿霉素和柔紅霉素，鏈霉菌通過ABC家族的DrrAB外排泵將這兩種抗生素運輸?shù)郊毎狻１疚膶rrAB外排系統(tǒng)的結構，DrrA和DrrB蛋白的表達與相互作用以及該復合物的裝配和多藥外排功能的研究進展做一簡要綜述。

鏈霉菌；抗生素；DrrAB外排系統(tǒng)

ABC(ATP-binding cassette)超家族蛋白參與很多生物學進程，包括轉移不同的分子和藥物。典型的ABC家族蛋白包括兩個核苷酸結合結構域(nucleotide-binding domain[NBD])和兩個跨膜結構域(transmembrane [TM])[1]。微生物需要一個或更多的自身抗性基因產(chǎn)生抗生素，抗性基因一般情況下與抗生素產(chǎn)生基因位于一個操縱子內[2]。通常發(fā)現(xiàn)多重的而不是單一的抗性機理產(chǎn)生抗生素抗性。鏈霉菌是一個能夠產(chǎn)生抗腫瘤藥物阿霉素和柔紅霉素的土壤微生物，本身對這兩種抗生素產(chǎn)生抗性。鏈霉菌包括DrrAB和ric2兩個抗性基因，使鏈霉菌對這兩個抗生素產(chǎn)生抗性。阿霉素和柔紅霉素的合成基因和抗性基因DrrAB位于鏈霉菌的一個基因簇內。ric2基因座不位于柔紅霉素產(chǎn)生的基因簇內，也對柔紅霉素具有抗性。目前研究的較為清楚的是DrrAB外排泵[1]。DrrAB外排泵編碼一個ABC型轉運體，DrrAB屬于DRA家族的ABCA亞家族[3]，該轉運體將這兩個結構相關的抗生素排到細胞外。

DrrAB是一個典型的原核轉運體,由DrrA和DrrB兩個不同基因編碼，DrrA屬于ABC家族蛋白，包含ABC蛋白催化亞基的所有保守基序 (包括Walker A,Walker B,Q-loop,signature基序,和switch基序)，即DrrA屬于ABC家族的核苷酸結合(nucleotide binding domains，NBD)的催化結構域。DrrB基因的產(chǎn)物是一個整合膜蛋白，與細菌的ABC轉運體的膜成分同源，屬于ABC家族的跨膜結構域(transmembrane domains，TMD)，包含8個跨膜α-螺旋[2]。DrrAB系統(tǒng)，催化功能和膜轉移功能位于不同的亞基上，然而這兩個亞基緊密偶聯(lián)的行為使其更像一個蛋白質的兩個結構域[4]。兩個DrrA和兩個DrrB形成一個四聚體復合物，外排阿霉素和柔紅霉素。盡管這4個結構域位于兩個不同的亞基上，但是這兩個亞基表現(xiàn)出很強的結構和功能的相互依賴性。因此，核苷酸結合結構域DrrA以阿霉素依賴的模式與DrrB結合形成復合物時才結合ATP或GTP。另外如果DrrA不能與DrrB同時表達則DrrB會被完全降解[2]。

1 DrrAB外排泵的定位

大部分ABC轉運體，包括P-gp(人類與腫瘤抗藥性相關的ABC家族蛋白)，由兩個核苷酸結合結構域和兩個由6個α-螺旋組成的跨膜結構域組成，在P-gp中，這4個結構域形成一個大的170 kDa蛋白。而Drr系統(tǒng)包括兩個亞基，DrrA和DrrB，各自具有不同的結構域[3]。一個單體的DrrA和一個單體DrrB形成的一個分子約為P-gp一半大小，DrrA包含一個核苷酸結合結構域與其他的ABC家族蛋白的通透酶同源，DrrB基因編碼產(chǎn)物為一個8次跨膜蛋白。DrrB也與其他的ABC家族的跨膜結構域同源，DrrA和DrrB蛋白質量分別為35.5和30.6 kDa,將DrrA和DrrB基因克隆到大腸桿菌表達載體，形成pDx101質粒，轉化大腸桿菌細胞，將含有該質粒細胞的細胞質和細胞膜分離，使用DrrA和DrrB抗體檢測DrrA和DrrB蛋白定位。帶有pDx101質粒的E.coliTG1細胞被分成細胞質和細胞膜兩部分，以抗DrrA或抗DrrB血清使用WB及密度分析儀分析。結果表明大約60% DrrA蛋白是與膜結合的，轉入空載體的對照細胞中，細胞質和細胞膜上都沒有檢測到DrrA的表達?？笵rrB血清密度儀分析結果表明92%的DrrB主要定位于膜上。使用整合膜蛋白SecY抗體，細胞質基質蛋白CAT和 EFG抗體對細胞質和細胞膜交叉污染分析表明，只有痕量的SecY位于細胞質中，表明交叉污染存在的較少。密度儀分析表明95% SecY ，9% EFG,and 11% CAT位于細胞膜部分。因此，DrrA在細胞質和細胞膜上的比例約為1∶1。對含有DrrB的細胞加熱到90℃ 10min導致DrrB蛋白的大量減少，表明其膜定位特征[5]。

含有DrrA和DrrAB的總膜用1.5 mol/L尿素處理后大約90% DrrA仍然與膜結合，6mol/L尿素處理總細胞膜后檢測不到DrrA，而DrrB用6 mol/L尿素抽提后仍不受影響，表明DrrB是整合膜蛋白，而DrrA是與膜上的DrrB或DrrAB結合的外周膜蛋白[3]。說明DrrA是ABC超家族外排泵DrrAB的核苷酸結合結構域，是一個外周膜蛋白，而DrrB是整合膜蛋白是該外排泵的跨膜結構域。

2 DrrA或 DrrB 蛋白的表達及相互作用

DrrA和DrrB基因克隆到大腸桿菌表達載體，形成pDx101質粒，及單獨將DrrA 或DrrB蛋白插入到載體中形成pDX102和pDX103質粒，E.coliTG1細胞含有上述質粒后細胞分離細胞質和細胞膜部分。用抗DrrA 或抗DrrB抗體以WB分析，條帶的亮度以密度儀分析?？笵rrA血清的WB分析結果表明DrrA在含有pDX101和pDx102質粒的細胞中表達，而含有pDX102質粒的細胞表達水平低于含有pDX101質粒的細胞。密度儀分析結果表明帶有pDX102質粒的細胞DrrA的表達是帶有pDX101質粒細胞的70%。用抗DrrB抗血清的WB結果表明DrrB只在含有pDX101的細胞中有表達，在含有pDX103質粒的細胞中DrrB幾乎不表達[4]。帶有pDX103質粒的E.coliTG1細胞與帶有DrrA基因的兼容質粒pDX108共轉化大腸桿菌細胞。細胞中DrrB的表達可以被反向存在的DrrA修復。表明DrrB在細胞內的表達需要DrrA蛋白的存在[4]。在含有pDX101質粒的細胞，DrrA和DrrB蛋白能被檢測到。而DrrA基因亞克隆到pDX102載體上，DrrA被檢測到的水平低于pDX101,表明DrrB可能影響或穩(wěn)定DrrA的表達。DrrA對DrrB表達和穩(wěn)定的影響似乎更強烈。DrrB基因亞克隆到pDX103載體時檢測不到DrrB蛋白的表達，而pDX101,pDX102,pDX103都包含相同的啟動子，那么DrrB表達的調節(jié)就應該是翻譯或翻譯后水平的。DrrA和DrrB在原始啟動子下的翻譯因其起始密碼子與DrrA的終止密碼子重疊而偶聯(lián)[4]。進一步的實驗表明同時表達DrrA,無論是在正向還是在反向，都對維持DrrB表達很關鍵。當以兼容質粒將DrrA和DrrB基因共同轉化到相同的細胞，pDX103翻譯DrrB蛋白，其水平與pDX101相似，暗示DrrB蛋白可能是翻譯后水平的調節(jié)[3]。在pDX103質粒的細胞中DrrB是被翻譯的，但是這個蛋白在WB上檢測不到。當含有DrrA的質粒pDX108共轉化，DrrB又能夠被檢測到其表達水平與在pDX101質粒的細胞中相當。因此有理由認為當沒有DrrA存在時DrrB被降解[4]。

DrrA除調節(jié)DrrB的穩(wěn)定性和膜插入功能，DrrA本身功能也依賴于與DrrB的相互作用。DrrA是一個ATP/GTP結合蛋白。ATP的結合特征以包含pDX101或pDX102質粒的大腸桿菌細胞的細胞質和細胞膜部分確定。交聯(lián)實驗表明DrrA只在含有DrrB的膜部分才與ATP交聯(lián)。單獨的DrrA不與ATP交聯(lián)。使用DrrA 或DrrB抗體WB分析表明DrrA在所有情況下都可檢測到，而DrrB則不是這樣的，另外，檢測了是否細胞內可溶性的DrrA能與ATP交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)即使DrrAB都表達的細胞可溶性的DrrA也不與ATP交聯(lián)，只有與膜結合的DrrA與ATP交聯(lián)[4]。表明DrrA與DrrB在膜上的特異相互作用誘導DrrA與ATP結合結構域的構象改變，而使其只有與膜結合時才能與ATP結合。因此如果沒有DrrB盡管DrrA可以與膜結合但是卻沒有活性。因此，DrrB穩(wěn)定的在膜上表達依賴于DrrA,而DrrA結合或水解ATP依賴于膜上DrrB的存在。在這方面，DrrAB復合物是一個典型的ABC轉運體，該復合體的兩個成分以相互幫助的模式存在[4]。

基于目前的數(shù)據(jù)認為DrrA是一個變構蛋白，在有或無DrrB和配體阿霉素存在時具有不同的構象，在未形成復合物時DrrA是位于構象I，該狀態(tài)不能與ATP結合。與DrrB結合后使DrrA維持在細胞膜上，并使DrrA構象改變變成活化狀態(tài)的II，活化狀態(tài)的DrrA底物結合變成構象III,該構象是由構象II與阿霉素結合變成的。在這種構象下DrrA能夠與ATP結合形成交聯(lián)狀態(tài)[4]。

3 DrrA與DrrB相互作用的功能位點及DrrB的拓撲結構

以前的研究認為ABC轉運體的核苷酸結構域的C端不包含任何與功能或裝配有關的保守基序，最近有些實驗研究并報道了一些ABC蛋白的C端可能具有特殊的功能。然而C端的氨基酸序列，只在相關蛋白中才比較保守。大腸桿菌的MalKC端的基序結合MalT和EIIglc在調節(jié)表達和在誘導物排除中扮演重要功能[6]。在甲烷八疊球菌作為非糖類ABC轉運體的鉬酸鹽/鎢酸鹽轉運體MaModBC的調節(jié)結構域位于ModCC端[7]，這些蛋白質的晶體結構分析表明位于C端的結構域都包含一個類似β-sheet的折疊，盡管它們執(zhí)行不同的轉移功能和具有不同的氨基酸殘基組成[2]。以MalK為模板對DrrA進行同源建模發(fā)現(xiàn)DrrA C端也有一個類似β-sheet的結構。并發(fā)現(xiàn)兩個保守的基序對DrrAB復合物裝配起關鍵作用。一個基序位于DrrA的C端富含谷氨酸殘基，命名為CREEM。第二個基序LDEVFL,位于CREEM的上游。通過同源序列比對，這兩個基序在原核和真核生物的ABC轉運體中是保守的，尤其是在ABCA亞家族的蛋白1，2，3和8，以及Ced-7，與DrrAB一樣屬于ABC超家族的DRA亞家族。通過定點突變和截短突變證實DrrA的C端LDEVFL和CREEM基序在DrrA-DrrB復合物相互作用和裝配上起重要作用。DrrA的C端的調節(jié)基序，LDEVFL和富含谷氨酸的調節(jié)基序(CREEM) 直接參與膜蛋白DrrB的N端胞質尾部相互作用及DrrA同源二聚體的形成。二硫化物交聯(lián)分析實驗表明CREEM和緊挨該基序的上游直接參與了DrrA與DrrB的N端的相互作用。LDEVFL和CREEM基序一系列突變嚴重影響DrrAB轉運體的功能。LDEVFL基序突變也會嚴重影響DrrA C端和DrrB N端的相互作用以及DrrA和DrrB的共純化，因此表明LDEVFL基序調節(jié)CREEM調節(jié)的DrrA和DrrB相互作用并在DrrAB復合物的生物起源上扮演重要作用。建模分析表明LDEVFL基序對DrrA C端構象的完整上是非常重要的，并證實DrrA C端形成一個獨立的結構域[3]。DrrA的第三個結構域GATE(Glycine-loop And Transducer Element)位于NBD結構域的switch結構域的下游，包括33個氨基酸參加，這段氨基酸殘基在ABC家族中比較保守，該結構域在DrrAB復合物的催化功能中起重要作用[2]。另外DrrA N端的Q-loop區(qū)域在DrrA形成同源二聚體和與DrrB形成異源二聚體中也具有重要作用[8]。

DrrB蛋白在260位點包含一個半胱氨酸，而DrrA蛋白沒有半胱氨酸。通過位點直接突變的方法對DrrB第260位的半胱氨酸突變成絲氨酸。然后在沒有半胱氨酸的DrrB中引入20個半胱氨酸替換。替換的半胱氨酸在DrrB中的定位是基于對DrrB的拓撲結構模型的建立，發(fā)現(xiàn)DrrB有8個跨膜結構域且N端和C端都位于細胞質中。為了鑒定DrrB與DrrA直接相互作用區(qū)域，使用了一個外源的半胱氨酸到氨基的化學交聯(lián)試劑GMBS。研究結果顯示DrrA與DrrB的C端和N端都交聯(lián)，表明這兩個區(qū)域都參與與DrrA的相互作用[9]。

在DrrB蛋白中鑒定了位于N端的胞質尾部的一段序列，這個序列與大腸桿菌維生素B12攝取的BtuC中已經(jīng)鑒定的L-環(huán)相似。通過晶體結構分析，L-loop 基序位于BtuC的表面，而這個攝取系統(tǒng)的膜成分BtuD通過兩個結構域與BtuC結合。發(fā)現(xiàn)DrrB的N端結構域與DrrA交聯(lián)的序列與最近在BtuC晶體結構中鑒定的“L-loop” 基序序列相似。根據(jù)BtuCD復合物晶體結構，BtuC上的L-loop環(huán)形與ABC原件BtuD廣泛的接觸。已經(jīng)有文獻報道藥物外排泵MDR1、LmrA,脂質外排泵MsbA,第1個胞質環(huán)以及CFTR的第4個胞質環(huán)中都有這個相似的序列L-loop。通過目前的研究發(fā)現(xiàn)DrrB胞質尾部N端的序列與L-loop相似這個區(qū)域可能是與DrrA相互作用的位點。在DrrB和BtuC,這個序列都位于這兩個蛋白質的螺旋形成的胞質結構域，BtuC的L-loop與其他的輸入泵的EAA loop相似[9]。進一步推測DrrB和其他的外排泵(輸入泵BtuC)包括一個保守的基序由序列GE-1..A3R/K..G7組成，很可能這個基序是由位于結合蛋白依賴性的通透酶上的EAA 基序(E1AA3RALG7)修飾形成的。表明EAA基序或其修飾形成的基序位于攝取系統(tǒng)和外排系統(tǒng)中，表明這個相互作用的基序來源于一個共同的在攝取系統(tǒng)和外排系統(tǒng)還沒有發(fā)生分歧的祖先。這個基序位于在DrrB的N端而不是C端。值得一提的是，這個基序位于DrrB第3個胞質環(huán)226和248位的。在三維結構中這個區(qū)域很可能與DrrB N端保守結構域相互靠近形成一個與DrrA相互作用的表面，既然DrrA和 DrrB這種結合防止DrrB被降解，因此DrrA很可能起到一個分子伴侶的作用便于復合物在膜上正確裝配。另外，DrrB能精確的調節(jié)DrrA的催化活性[9]。同時基于預測工具，例如Kyte-Doolittle and Top-pred,DrrB被預測含有6個輸水結構域。使用基因融合方法分析了DrrB蛋白的拓撲結構。發(fā)現(xiàn)DrrB包含8個跨膜結構域，并且N端和C端都位于細胞質中[10]。DrrB拓撲結構的了解可以幫助我們闡明參與DrrA和 DrrB相互作用的結構域。研究表明DrrB包含一個長的N端胞質尾部，3個胞質環(huán)和一個短的C端尾部，可能是與DrrA相互作用的位點。

4 DrrAB的多藥外排功能

藥物轉運體分為單藥轉運體(特異性的轉移某一類藥物)和多藥轉運體，多藥轉運體能夠轉移結構和功能不相關的復合物。這些蛋白質的功能屬于初級主動運輸(屬于ATP 結合盒超家族)和次級主動運輸。多藥抗性這種現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞，在抗藥性腫瘤細胞中都發(fā)現(xiàn)了一個ABC型外排泵如P-gp的過表達。這些蛋白表現(xiàn)出可以轉移上百種結構不相關的復合物，包括雙親的抗腫瘤藥物，肽和熒光染料等，因此在腫瘤細胞中稱為多藥外排泵(MDR)。MDR也廣泛的存在于細菌中：細菌中研究比較清楚的ABC家族成員包括乳酸乳球菌的LmrA和LmrCD，金黃色葡萄球菌的Sav1866及大腸桿菌的MsbA[11]。

DrrAB因為其外排阿霉素和柔紅霉素的專用性質，DrrAB系統(tǒng)一直被認為屬于單藥外排泵。通過使用大腸桿菌完整細胞和內膜外翻膜泡(inside-out membrane vesicles ，IOVs)體外系統(tǒng)和體內證實DrrAB系統(tǒng)不但能夠轉移阿霉素也能外排兩個被廣泛研究的MDR底物：Hoechst 33342和溴化乙錠( ethidium bromide)。另外，也證明其他的被多藥轉運體廣泛使用的底物(包括異搏定、長春花堿和利福平)能夠以較高的效率抑制DrrAB調節(jié)的阿霉素的轉移，表明他們也是DrrAB的底物。動力學研究表明阿霉素的轉移可被Hoechst 33342 和利福平以競爭性方式抑制，而異搏定可以非競爭性機制抑制阿霉素的轉移，表明DrrAB系統(tǒng)可能有超過一個藥物結合位點[12]。DrrAB調節(jié)的外排能量即可以來自于ATP 或來自GTP 水解，能量不依賴于質子動力勢。說明阿霉素專用的外排系統(tǒng)DrrAB,能夠識別和轉移多種藥物。這個研究強調在DrrAB系統(tǒng)和P-gp存在共同的藥物底物，表明MDR蛋白在進化中有共同的作用機理。因為P-gp和其他的MDR蛋白例如細菌的MDR蛋白，富含芳香族氨基酸殘基，P-gp和細菌的 MDR蛋白分別為18%和15.4%，而單藥外排泵TetA的芳香族氨基酸含量為(9.4%)。Pawagi 等提出大量的芳香族氨基酸的存在可能通過分成不同的結合位點與減少底物特異性有關。最近的三維結構研究證實P-gp的藥物結合空腔是大部分由疏水和芳香族氨基酸殘基組成的。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)DrrB的TM螺旋芳香族氨基酸殘基含量相對較高為(15%)，與P-gp (18%)和細菌MDR protein(15.4%)芳香族氨基酸殘基更接近。是否DrrB中存在的這類氨基酸殘基與多藥抗性有關還有待進一步研究[12]。

DrrAB系統(tǒng)是一個相對簡單的ABC藥物轉運體，由兩個蛋白質DrrA (催化亞基)和DrrB (整合膜亞基)裝配形成。在哺乳動物的P-gp,兩個催化亞基和兩個整合膜蛋白結構域融合成一個單獨的肽鏈，這可能是進化過程中的基因融合事件。DrrAB和P-gp都表現(xiàn)出對抗腫瘤藥物阿霉素和柔紅霉素的抗性：DrrAB來自于產(chǎn)生抗生素的有機體，P-gp在腫瘤細胞中表達[12]。DrrA和DrrB之間存在較強的相互作用?；讷@得的數(shù)據(jù)，可以推測DrrAB是由兩個DrrA和兩個DrrB亞基組成的，排列成A1B1A2B2形式，這使DrrAB外排泵與人類的抗腫瘤外排泵P-gp結構域數(shù)量和總體結構相似，都包含兩個NBD結構域和兩個TMD結構域[4]。

DrrAB是一個典型的原核轉運體，由兩個不同基因編碼，然而這兩個亞基緊密偶聯(lián)行為上更像一個蛋白質的兩個結構域。DrrA除調節(jié)DrrB的穩(wěn)定性和膜插入功能，DrrA本身功能也依賴于與DrrB的相互作用。DrrA是一個ATP/GTP結合蛋白?，F(xiàn)有證據(jù)表明DrrA與DrrB在膜上的特異相互作用誘導DrrA ATP結合結構域的構象改變，而使其只有與膜結合時才能與ATP結合。因此如果沒有DrrB盡管DrrA可以與膜結合但是卻沒有活性。因此，DrrB穩(wěn)定的在膜上表達依賴于DrrA,而DrrA結合或水解ATP依賴于膜上DrrB的存在。在這方面，DrrAB復合物是一個典型的ABC轉運體，該復合體的兩個成分以相互幫助的模式存在[4]。DrrA屬于ABC-2亞家族，通過對DrrAB結構和功能的闡述有望能幫助我們進一步了解ABC-2亞家族成員的功能，了解這個亞家族和其他ABC蛋白的進化關系[10]。對細菌藥物外排泵DrrAB的研究和可以幫助我們加深對P-gp進化和功能的了解[5,9,13]。

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Progress in research of the DrrAB efflux system ofStreptomycespeucetius

FENG Zhen-yue,LIU De-fu,LIU Shuo,WANG Li-zi,CUI Yu-dong

(1.HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China; 2.DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,Daqing163319,China)

The bacteriumStreptomycespeucetiusproduces doxorubicin and daunorubicin,and the two widely used anticancer antibiotics. Two open reading frames,drrA and drrB,were proposed to encode for an ABC (ATP-binding cassette) type of permease that carries out export of the antibiotic ABC (ATP binding cassette)-type transporter for the exportation of these two antibiotics. In this paper,the structure,expression and interaction of DrrA and DrrB protein and the research progress of the assembly and multi drug efflux function of DrrAB are briefly reviewed.

Streptomycespeucetius; antibiotics; DrrAB efflux system

Cui Yu-dong,Email: 1016856109@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.013

黑龍江八一農墾大學校內培育課題(No.XZR2015-11)

崔玉東，Email：1016856109@qq.com

1.黑龍江八一農墾大學，大慶 163319; 2.黑龍江省農科院大慶分院，大慶 163319

Q93

A

1002-2694(2017)05-0454-05

2016-10-26 編輯：劉岱偉

Supported by the School Cultivation Subject of Heilongjiang Bayi Agricultural University (No. XZR2015-11)