蜜蜂體表攜帶花粉種類(lèi)、數(shù)量和活力評(píng)估的研究方法

陳新蘭 董 坤

（1 云南省蜜蜂資源可持續(xù)利用工程研究中心 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

蜜蜂體表攜帶花粉種類(lèi)、數(shù)量和活力評(píng)估的研究方法

陳新蘭1,2 董 坤1

（1 云南省蜜蜂資源可持續(xù)利用工程研究中心 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

蜜蜂在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的地位越來(lái)越重要，其授粉效率直接關(guān)系到農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量?；ǚ酆突凼敲鄯涞闹饕澄飦?lái)源，其中花粉采集與蜜蜂的授粉效率關(guān)系密切。蜜蜂在采集花蜜或花粉時(shí)，身上會(huì)粘附花粉，蜜蜂在同種植物的不同花朵之間穿梭采集并無(wú)意中將花粉帶到柱頭上從而完成授粉。本文主要綜述了蜜蜂體表攜帶花粉種類(lèi)鑒定、花粉粒計(jì)數(shù)及花粉活力測(cè)定等方面的研究方法，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為其他同仁開(kāi)展此類(lèi)研究提供一些有益的幫助。

蜜蜂；花粉；授粉；花粉活力

在自然界中，大約85%的顯花植物依賴(lài)?yán)ハx(chóng)授粉，其中蜜蜂是最理想的授粉昆蟲(chóng)。據(jù)1899年Knutr記載，在植物上采集到的800多種傳粉昆蟲(chóng)中，膜翅目就占了43.7%，且蜜蜂總科占其總數(shù)55.7%[1]。此外，我國(guó)吳燕如教授曾調(diào)查了獼猴桃花期中傳粉昆蟲(chóng)的種類(lèi)，共鑒定的16種傳粉昆蟲(chóng)中，蜜蜂占68.75%[2]。由此可見(jiàn)，蜜蜂在植物授粉中占據(jù)著重要的地位。

蜜蜂授粉不僅可以增加農(nóng)作物的產(chǎn)量、改善果實(shí)和種子的品種以及提高后代的生活力，還有利于生態(tài)環(huán)境的改善[3]。本課題組在開(kāi)展中蜂為騰沖紅花油茶授粉效果研究中發(fā)現(xiàn)，中蜂自由式授粉可以顯著提高騰沖紅花油茶的坐果率及結(jié)籽率[4]；此外，在研究蜜蜂為石榴授粉中發(fā)現(xiàn)，蜜蜂授粉可以提高石榴的坐果率及果實(shí)品質(zhì)[5]。國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的大量研究均表明蜜蜂授粉對(duì)農(nóng)作物和果樹(shù)等的增產(chǎn)是不可估量的。

蜜蜂的授粉性能可以從三個(gè)方面考慮：測(cè)定蜜蜂訪(fǎng)花后的坐果率或結(jié)籽率；測(cè)定蜜蜂體表攜帶的花粉種類(lèi)、數(shù)量以及柱頭上有效的花粉落置數(shù)量；測(cè)定蜜蜂授粉后植物的繁殖成功率，即生殖效率[6]。蜜蜂體表攜帶花粉的種類(lèi)數(shù)量及柱頭上有效的花粉落置量，在一定程度上影響著授粉成功與否。由于繁殖成功不僅依賴(lài)于傳粉昆蟲(chóng)傳播的花粉數(shù)量，也依賴(lài)于其他因素，比如：花粉和雌蕊的相互作用、雌花的選擇，所以在評(píng)估蜜蜂的授粉性能時(shí)，主要對(duì)前兩個(gè)方面進(jìn)行觀(guān)察[7]。本文主要介紹了國(guó)內(nèi)外針對(duì)蜜蜂體表攜帶花粉種類(lèi)鑒定、花粉粒計(jì)數(shù)及花粉活力測(cè)定等方面的研究方法，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為其他同仁開(kāi)展此類(lèi)研究提供一些有益的幫助。

1 花粉種類(lèi)鑒定方法

鑒定蜜蜂體表攜帶的花粉種類(lèi)，首先需從蜜蜂體表淋洗花粉粒。可通過(guò)沖洗或渦旋蜜蜂身體使其身上的花粉粒淋洗下，然后通過(guò)離心方法使花粉粒沉淀，得到的花粉粒用于進(jìn)一步的分析。為了研究授粉效率，蜜蜂后足花粉筐里的花粉團(tuán)在淋洗蜜蜂前應(yīng)該去掉，因?yàn)榛ǚ蹐F(tuán)通常對(duì)授粉沒(méi)有太大作用。如果對(duì)蜜蜂的采集行為觀(guān)察非常細(xì)致，也可只從蜜蜂身體接觸了柱頭的部位上取下花粉進(jìn)行分析鑒定[8]。

蜜蜂身上攜帶的來(lái)自不同植物的花粉，通?？梢砸揽吭\斷其性狀來(lái)區(qū)分，比如：花粉粒的大小、花粉外壁紋飾、花粉孔和花粉溝的數(shù)量及大小等[9]。光學(xué)顯微鏡是最早用于觀(guān)察研究花粉的工具，至今已有300多年的歷史，且一直沿用至今。到了20世紀(jì)60年代，掃描電子顯微鏡開(kāi)始用于觀(guān)察花粉，其所得圖片不僅立體感強(qiáng)、清晰逼真，且能揭示很多光學(xué)顯微鏡所無(wú)法揭示的信息，近幾十年已在花粉形態(tài)研究中廣為應(yīng)用[10]。目前有研究人員也開(kāi)始嘗試通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定花粉種類(lèi)。

1.1 光學(xué)顯微鏡的鑒定方法

這是鑒定花粉運(yùn)用最廣的一種方法。在花粉鑒定前，花粉要經(jīng)過(guò)醋酸水解及染色，醋酸水解溶液包括冰醋酸和濃硫酸（9:1），其水解及染色過(guò)程為[7]：

（1）加入花粉樣本于冰醋酸溶液中10 min，然后進(jìn)行離心，棄去上清液；

（2）加入少量摩爾的醋酸水解混合液（冰醋酸:濃硫酸=9:1）；

（3）在水浴中將溶液緩緩加熱到沸點(diǎn)，并用玻璃棒不停的攪拌；

（4）將溶液冷卻幾分鐘，進(jìn)行離心，然后棄去上清液；

（5）重新懸浮在蒸餾水中，進(jìn)行離心，然后輕輕倒出上清液，重復(fù)這個(gè)步驟；

（6）用甲基綠或醋酸洋紅進(jìn)行染色，以便更好觀(guān)察。

醋酸水解及染色之后，花粉可以保存，并制成永久裝片，常用方法是用甘油膠封片。其過(guò)程如下[7]：

（1）準(zhǔn)備少量的甘油明膠，通常由10 g 明膠、30 ml 甘油和35 ml 蒸餾水混合而成；

很多教師有這樣一種觀(guān)點(diǎn)，認(rèn)為解題能力的培養(yǎng)必須通過(guò)難度大的綜合題的訓(xùn)練才能實(shí)現(xiàn)，其實(shí)學(xué)習(xí)解題一定要從新授課開(kāi)始，從簡(jiǎn)單題開(kāi)始，這是學(xué)生最容易接受的途徑，關(guān)鍵是教師要善于利用教材資源，挖掘其內(nèi)在的教學(xué)價(jià)值．“l(fā)1⊥l2?k1k2=-1”是個(gè)簡(jiǎn)單問(wèn)題，但通過(guò)探究得到了很多富有啟發(fā)性的解決方法，其對(duì)學(xué)生思維的影響是講幾道難題、介紹幾種解題方法不能相比的．沒(méi)有方法不可怕，不會(huì)思考才可怕．

（2）在干凈的顯微鏡載玻片上加一滴準(zhǔn)備好的甘油明膠、花粉樣本和染色劑；

（3）緩緩地對(duì)裝片加熱，攪動(dòng)使其徹底地均勻混合；

（4）蓋上蓋玻片，在邊緣四周用指甲油或其他清漆封住即可。

利用光學(xué)顯微鏡觀(guān)測(cè)上述染色后的花粉或花粉永久玻片，通過(guò)花粉的外部形態(tài)和大小即可鑒定花粉的種類(lèi)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，科研人員可自己操作觀(guān)測(cè)，成本低，省時(shí)省力，對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)差異大的花粉易鑒定，但是對(duì)于差異小的花粉，很難對(duì)其進(jìn)行鑒定[11]。

1.2 掃描電子顯微鏡的鑒定方法

掃描電子顯微鏡也是鑒定花粉很普遍的方法，其一般過(guò)程是取花粉樣本，用導(dǎo)電膠將其固定樣品臺(tái)上，噴金，選用適當(dāng)電壓，然后進(jìn)行觀(guān)察[12]。用此方法可觀(guān)測(cè)到花粉外壁表面的紋飾、花粉孔及花粉溝的數(shù)量和大小，易鑒定差異小的花粉，但其成本高。由于掃描電子顯微鏡價(jià)格昂貴，通常有專(zhuān)門(mén)固定人員操作使用，科研人員一般只需送樣、等待電鏡圖片結(jié)果。

1.3 分子生物學(xué)的鑒定方法

鑒定花粉種類(lèi)還可以用分子生物學(xué)的方法。如果蜜蜂只攜帶同一個(gè)種的植物花粉粒，那這很簡(jiǎn)單，因?yàn)榇罅康幕ǚ劭梢院喜?，從而可以一起提取DNA。但是如果蜜蜂攜帶著不同種植物的混合花粉，分析混合花粉就變得很難。在這種情況下，可以用單一花粉基因型策略，即對(duì)單一花粉粒的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡，此方法能更精準(zhǔn)的確定花粉種類(lèi)，但操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力。

2 花粉數(shù)量觀(guān)測(cè)計(jì)數(shù)方法

2.1 血球計(jì)數(shù)板的觀(guān)測(cè)方法

這是花粉粒計(jì)數(shù)最常用的方法。血球計(jì)數(shù)板最初主要用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，但它也可以用于計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體積的花粉粒溶液中的花粉粒數(shù)量[7]。首先，將從蜜蜂身上收集的花粉制成花粉懸液，然后在血球計(jì)數(shù)板上滴一滴一定體積的花粉懸液，再放于顯微鏡下觀(guān)察，數(shù)出這滴懸液中花粉粒的數(shù)量，就能計(jì)算整個(gè)懸液中花粉粒的總量[14]。具體操作步驟如下：

（2） 使花粉粒懸浮在已知體積的70%乙醇溶液中，進(jìn)行渦旋以確?；旌暇鶆?；

（3）用移液管取一定量的花粉粒懸液于血球計(jì)上；

（4）在顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)數(shù)。血球計(jì)廠(chǎng)商規(guī)定了在觀(guān)察視野下的已知體積懸液，并提供簡(jiǎn)單的用法說(shuō)明（在初始懸液中，可以從目標(biāo)計(jì)數(shù)推回到絕對(duì)計(jì)數(shù)）；

（5）當(dāng)花粉粒的數(shù)量很少時(shí)，要測(cè)量的懸液可以滴在帶有刻度的顯微鏡載玻片上，然后數(shù)出所有的花粉粒。

2.2 其他方法

除了運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)花粉進(jìn)行計(jì)數(shù)外，還可使用成本更高的方法，如：電子粒子計(jì)數(shù)或基于激光的計(jì)數(shù)器。此外，也可使用立體顯微鏡直接對(duì)蜜蜂身上的花粉粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，但誤差相對(duì)更大。

3 花粉活力的測(cè)定方法

3.1 熒光反應(yīng)法（FCR）

這種方法主要用于測(cè)定花粉萌發(fā)前的花粉活力，此方法是基于二乙酸熒光素（FDA）的熒光反應(yīng)。FDA是一種可透過(guò)細(xì)胞膜并作為熒光素積蓄在活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，因此有活力的花粉一般都能在顯微鏡下發(fā)出熒光[15]。

3.2 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

根據(jù)有活力的花粉粒在呼吸過(guò)程中產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，無(wú)活力的花粉粒無(wú)此反應(yīng)的原理,當(dāng)氯化三苯基四氮唑（TTC）滲入有活力的花粉粒內(nèi)，并作為氫受體被脫輔酶上的氫還原時(shí)，便由無(wú)色的TTC變?yōu)榧t色的三苯基甲唑（TTF），這種方法適用于經(jīng)干燥等加工處理后的新鮮花粉，對(duì)陳舊不新鮮的花粉不適用。具體方法步驟是：從蜜蜂身上取少量花粉放于載玻片上，加0.5%的TTC溶液1~2滴，然后蓋上蓋玻片，放于35℃左右的恒溫箱中15 min，最后用顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，有活力的花粉染成深紅色，敗育花粉染成綠色[16]。

3.3 過(guò)氧化物酶測(cè)定法

有活力的花粉含有活躍的過(guò)氧化物酶，此酶能利用過(guò)氧化氫使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉的活性強(qiáng)弱。具體方法步驟是：首先將0.5%聯(lián)苯胺、0.5% α-萘酚和0.25%碳酸鈉混合均勻，然后滴1滴于載玻片上，再滴1滴0.3%過(guò)氧化氫，然后放入少量花粉，攪勻，蓋上蓋玻片，于30℃環(huán)境下放置30 min左右，最后在顯微鏡下觀(guān)察，有活力的花粉呈現(xiàn)紅色[17]。

3.4 碘-碘化鉀法（I-KI）

此法常用于鑒定含淀粉質(zhì)類(lèi)花粉，染成藍(lán)紫色的為發(fā)育好、活力強(qiáng)的花粉，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。具體方法步驟是：取少量花粉放于載玻片上，先加1滴蒸餾水，再加2滴碘-碘化鉀溶液（將2 g碘化鉀溶于10 ml蒸餾水中，再加入1 g碘，用玻璃棒攪拌至全部溶解，最后加蒸餾水定容到300 ml），蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀(guān)察，被染成藍(lán)色的即為有活力的花粉[17]。

3.5 蔗糖溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)法

蔗糖培養(yǎng)基由10%蔗糖、100 mg/kg硼酸和5 mg/kg赤霉素配制而成，其中，蔗糖的作用是維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡，以及提供花粉萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來(lái)源，不同植物花粉的萌發(fā)所需要的蔗糖濃度不同；硼酸的作用是促進(jìn)糖的吸收和代謝，同時(shí)增加氧的吸收，這有利于花粉的萌發(fā)，不同植物花粉萌發(fā)所需要的硼濃度也有所不同。具體方法步驟是：將新鮮花粉直接放于蔗糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12 h后，在顯微鏡下觀(guān)察，如果花粉管有明顯的伸長(zhǎng)（花粉管的長(zhǎng)度至少是花粉粒直徑的2倍），則為有活力的花粉[18]。

熒光反應(yīng)通常是測(cè)定花粉營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)膜的完整性和細(xì)胞質(zhì)非特異性酯酶的活性，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)明顯，容易觀(guān)察，但是二乙酸熒光素具有一定的毒性；TTC法、過(guò)氧化物酶法和I-KI法都是染色法，在染色過(guò)程中存在比較大的誤差性，但是省時(shí)省力，成本低；蔗糖溶液培養(yǎng)基法實(shí)用，簡(jiǎn)單，可直接觀(guān)察花粉管的發(fā)育情況，準(zhǔn)確性高，但耗時(shí)。

不同植物花粉的特性不同，所需要的適宜染色條件也不同[19]。TTC染色法常用于測(cè)定花粉活力的強(qiáng)弱，它的染色效果和花粉中的脫氫酶有一定的關(guān)系，王艷哲等[20]在研究測(cè)定玉米花粉活力發(fā)現(xiàn)，TTC能準(zhǔn)確、快速的測(cè)定玉米花粉活力，但是有報(bào)道TTC法測(cè)定黎豆、辣椒等花粉活力時(shí)，效果不明顯或不能染色。I-KI染色法適宜測(cè)定淀粉質(zhì)類(lèi)花粉，即對(duì)禾本科類(lèi)植物的花粉進(jìn)行染色時(shí)，效果明顯。俞奔馳等[21]發(fā)現(xiàn)用I-KI法能準(zhǔn)確的測(cè)定木薯花粉的活力，但是TTC法和培養(yǎng)基法效果不理想。蔗糖溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)法適用廣，效果明顯，對(duì)大多數(shù)植物的花粉活力測(cè)定有顯著的效果。但需要注意的是，不同植物的花粉萌發(fā)所需的蔗糖、硼酸和赤霉素比例不同。綜上所述，不同的測(cè)定方法，對(duì)植物花粉的測(cè)定效果各不同，因此，應(yīng)結(jié)合花粉特性、染色效果、染色時(shí)間及試劑比例等條件來(lái)選擇一種合適的花粉測(cè)定方法。

[1] 曾志將. 試談蜜蜂授粉的重要性[J]. 養(yǎng)蜂科技，1988，(1):24.

[2] 楊龍龍，吳燕如. 獼猴桃傳粉蜜蜂的初步研究[J]. 中國(guó)蜂業(yè)，1990, 41(1):2-4.

[3] 邵有全. 蜜蜂授粉[M]. 太原: 山西科學(xué)技術(shù)出版社，2001:113.

[4] 李林庶，董坤，王友文，等. 東方蜜蜂為騰沖紅花油茶授粉效果研究[J]. 中國(guó)蜂業(yè)，2014, 65(1-3):33-36.

[5] 陶德雙，董霞，董坤，等. 中華蜜蜂為石榴授粉效果研究[J].蜜蜂雜志，2010(3):10-11.

[6] Ne'eman G, Jurgens A, Newstrom-Lloyd L. A framework for comparing pollinator performance: effectiveness and efficiency[J]. Biological Reviews, 2010, 85(3):435-451.

[7] Keith S Delaplane, Arnon Dag, Robert G Danka, et al.Standard methods for pollination research with Apis mellifera [J].Journal of Apicultural Research, 2013, 52(4):1-27.

[8] Jones G. Pollen extraction from insects [J]. Palynology, 2012,36(1):86-109.

[9] 方從兵. 我國(guó)果樹(shù)孢粉學(xué)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002, 29 (2):154-157.

[10] 王伏雄等. 中國(guó)植物花粉形態(tài)[M]. 第2版. 北京: 科學(xué)出版社，1995:461.

[11] Gretchen D. Jones, Vaughn M. Bryant Jr. A comparison of pollen counts: Light versus scanning electron microscopy[J].Grana, 2007, 46(1):20-33.

[12] 張秋萍，徐瑞雅，趙俊霞. 蜜源植物花粉的觀(guān)察[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1989, 13(4):27-34.

[13] Matsuki Y, Tateno R, Shibata M. Pollination ef fi ciencies of f lower-visiting insects as determined by dirtect genetic analysis of pollen origin [J]. American Journal of Botany, 2008, 95(8):925-930.

[14] Human H, Brodschneider R, Dietemann V, et al.Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research [J].Journal of Apicultural Research, 2013, 52(4):1-10.

[15] Heslop-Harrison JS, Heslop-Harrison Y. Evaluation of pollen viability by enzymatically induced fluorescence: intracellular hydrolysis of fluorescein diacetate [J]. Stain Technology, 1970,45(3):115-120.

[16] Alexander M P. Differential staining of aborted and nonaborted pollen [J]. Stain Technology, 1969, 44(3): 117-122.

[17] He XD, Zhao ZL, Zhou K, et al. The comparison of pollen viability determination among 17 ornamental trees of prunus [J].Journal of Nanjing Forestry University, 2005, 29(2): 29-32.

[18] 趙統(tǒng)利，周翔，朱朋波，等. 百合花粉生活力測(cè)定方法的比較研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(5):88, 144.

[19] 姜雪婷，杜玉虎，張紹鈴，等. 梨43個(gè)品種花粉生活力及4種測(cè)定方法的比較[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2006, 23(2):178-181.

[20] 王艷哲，崔彥宏，李金才，等. 玉米花粉活力測(cè)定方法的比較研究[J]. 玉米科學(xué)，2010, 18(3):173-176.

[21] 俞奔馳，李軍，盤(pán)歡，等. 木薯花粉活力測(cè)定及驗(yàn)證試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012, 39(13):25-27.

Review on the methods of evaluating pollen identity, quantity and viability on honeybees

Chen Xinlan1,2, Dong Kun1
(1 Yunnan Provincial Engineering and Research Center for Sustainable Utilization of Honeybee Resources, Eastern Bee Research Institute, College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;2 College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Honeybees play a more and more important role in modern agriculture because their pollination ef fi ciency has a direct relation to yield and quality of crops. Pollen and nectar are mainly food source of honeybees,and their behavior of foraging pollen has a great relation to the pollination ef fi ciency of them. The pollen will adhere on the bodies of honeybees when they collect nectar or pollen, and the pollen on honeybees will touch the stigma and pollination will be fi nished. This paper mainly introduced the methods of evaluating pollen identity, pollen quantity and pollen viability on honeybees, their merit and demerit of these methods in order to provide some helpful advice to other researchers.

honeybee; pollen; pollination; pollen viability

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-45-KXJ14）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31460577）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31572339）

陳新蘭（1993-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榛刍瘜W(xué)與訪(fǎng)花行為

董坤，教授，E-mail：dongkun19722004@aliyun.com