酶解與包合技術制備水溶性花粉的比較研究（續(xù)）

（重慶市畜牧科學院，榮昌 402460）

酶解與包合技術制備水溶性花粉的比較研究（續(xù)）

劉佳霖 殷素會 高麗嬌 曹 蘭 羅文華 程 尚

（重慶市畜牧科學院，榮昌 402460）

（續(xù)《中國蜂業(yè)》2017年第10期）

2.4.5 纖維素酶+β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的HCl調節(jié)蜂花粉溶液pH=5.2，加入纖維素酶0.750 g（酶添加量為1500 U/g），65℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質量比為1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過濾。

2.4.6 果膠酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調節(jié)蜂花粉溶液pH=4.0，加入果膠酶0.469 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.25 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾。

2.4.7 果膠酶+β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的HCl調節(jié)蜂花粉溶液pH=4.0，加入果膠酶0.4688 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質量比為1∶4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過濾。

2.4.8 脂酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶3.750 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾。

2.4.9 脂酶＋β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的HCl調節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶3.750 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質量比為1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過濾。

2.4.10 β-葡萄糖苷酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.189 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過濾。

2.4.11 β-葡萄糖苷酶+β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.189 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應4 h。反應結束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質量比為1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過濾。

2.5 蛋白質及黃酮含量測定

2.5.1 蛋白質含量測定：標準曲線測定：采用考馬斯亮藍蛋白質定量試劑盒方法[21]，將0、40、80、120、160、200、240 μl牛血清蛋白BSA標準溶液分別加入試管中，加入PBS補足600 μl（600、560、520、480、440、400、360 μl ），向各試管加入11.40 mL考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置5～10 min，分別在595 nm處記錄吸光值。

測定蜂花粉水溶液的蛋白質含量：取50 ml產物溶液定容至500 ml，將適當體積的樣品加入到試管中，并用PBS補足到600 μl，在向各試管加入11.4 ml考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置5～10 min，分別在595 nm處記錄吸光值。

按下列公式計算水溶性蜂花粉的蛋白質提取率：

2.5.2 黃酮含量測定：標準曲線的制作：精密吸取蘆丁標準溶液（1000 μg/ml）：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml于10 ml比色管中，加5% NaNO2溶液0.3 ml，搖勻后放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，搖勻后靜置6 min，加入4%NaOH溶液4 ml在用乙醇或者水定容，搖勻，于波長510 nm處測定吸光度。對所測得的數(shù)據(jù)采用直線回歸法計算產物黃酮含量

出標準曲線的回歸方程，并以吸光度為橫坐標，對照品濃度為縱坐標繪制標準曲線[22]。

樣品的測定方法：精密吸取1 ml樣品溶液置于10 ml容量瓶中，加入乙醇（加入4 ml）至5 ml，加入NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系[22]，搖勻，以相應試劑做空白，于510 nm處測定吸光值，并計算樣品中總黃酮的含量。

按下列公式計算水溶性蜂花粉的黃酮提取率：

2.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，方差分析使用One-way ANOVA的LSD法，顯著水平P<0.05。

3 結果與分析

3.1 蛋白質及黃酮標準曲線

以BSA（牛血清標準蛋白）為橫坐標x（μl），595 nm處吸光值為縱坐標y作圖，制作的標準曲線在0～240 μl BSA范圍內符合方程y=0.0038x+0.0373，R2=0.996。

以蘆丁標準品為橫坐標x（μg），510 nm處吸光值為縱坐標y作圖，制作的標準曲線在0～500 μg 蘆丁標準品范圍內符合方程y=0.0011x-0.0083，R2=0.999。

3.2 酶解與包合技術制備水溶性花粉的比較

酶解與包合技術制備水溶性蜂花粉的結果如表1所示。單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉，水溶性蛋白質及黃酮提取率最高的為堿性蛋白酶及環(huán)糊精2:1，水溶性蛋白質提取率分別為84.55%和84.33%，黃酮提取率分別為19.51%和18.50%。采用酶解與包合復合技術制備水溶性花粉，水溶性蛋白質提取率最高的為果膠酶+β-環(huán)糊精和纖維素酶+β-環(huán)糊精，水溶性蛋白質提取率分別為95.40%和88.91%；水溶性黃酮提取率最高的為纖維素+堿性蛋白酶和纖維素酶+β-環(huán)糊精，黃酮提取率分別為35.93%和37.86%。綜合比較，采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質提取率和黃酮提取率，與空白對照相比可提高水溶性蛋白質提取率120.95%，提高水溶性黃酮提取率105.98%，顯著高于單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉的效果。

4 討論

蜂花粉是一種天然、綠色、安全的保健品[1,5,6]，水溶性、穩(wěn)定性及感官特性是限制其深加工及廣泛應用的關鍵難題。目前，蜂花粉的深加工通常采用真空冷凍干燥技術及超微粉碎技術制備高活性、低致敏的產品，但其理化性狀并沒有得到很大的改善，主要活性成分的提取仍處于發(fā)展階段。酶解改性技術是目前使用最廣泛的蛋白質改性技術，通過多種酶的內切或外切作用可以改變物料的理化特性和功能特性，該技術反應速度快、條件溫和、無有毒有害物質產生，能夠保證物料中的活性成分得到有效的保留[23,24]。本研究比較了多種蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、脂酶及葡萄糖苷酶制備水溶性花粉的效果，結果顯示，不同的酶制備水溶性蜂花粉的效果差異較大，堿性蛋白酶制備的水溶性蜂花粉蛋白質提取率和黃酮提取率最高，分別為84.55%和19.51%。與前人的結果一致[7]，堿性蛋白質制備水溶性蜂花粉的效果顯著高于其他酶。

包合技術是一種重要的蛋白質物理改性技術，一般采用環(huán)糊精為輔料，包合物料中的多種小分子物質，對其營養(yǎng)成分影響較小[25]。該技術在改善物料水溶性、穩(wěn)定性及感官特性等方面具有十分重要的作用，已廣泛應用于食品及醫(yī)藥等多個產業(yè)[26,27]。本研究比較了不同環(huán)糊精添加量對制備水溶性蜂花粉的影響，結果顯示，環(huán)糊精添加量對包合技術制備水溶性蜂花粉的影響較?。≒<0.05）, 環(huán)糊精2:1制備的水溶性蜂花粉蛋白質提取率和黃酮提取率最高，分別為84.33%和18.50%。包合技術和酶解改性技術制備水溶性蜂花粉的效果差異不顯著。

本研究在單一使用酶解與包合技術的基礎上進一步開展蛋白酶+纖維素酶、果膠酶、脂酶、葡萄糖苷酶以及環(huán)糊精+纖維素酶、果膠酶、脂酶、葡萄糖苷酶的復合工藝制備水溶性蜂花粉的比較研究。綜合結果顯示，采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉的效果最好，其水溶性蛋白質提取率為88.91%，水溶性黃酮提取率高達37.86%，顯著高于單一酶制劑或環(huán)糊精制備水溶性花粉的效果。由此，本研究認為，多種工藝的復合使用有利于蜂花粉深加工產業(yè)的進一步發(fā)展，在改善蜂花粉理化性狀，分離、純化蜂花粉主要活性物質方面具有十分廣闊的發(fā)展前景。

5 結論

采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質提取率和黃酮提取率，與空白對照相比可提高水溶性蛋白質提取率120.95%，提高水溶性黃酮提取率105.98%，顯著高于單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉的效果。多種技術的復合使用，有助于蜂花粉深加工的進一步發(fā)展。

[1] 劉建濤, 趙利, 蘇偉, 等. 蜂花粉生物活性物質的研究進展[J]. 食品科學, 2006, 27(12): 909-912.

[2] BRODSCHNEIDER R, CRAILSHEIM K. Nutrition and health in honey bees[J]. Apidologie, 2010, 41(3): 278-294.

[3] HUANG Z. Pollen nutrition affects honey bee stress resistance[J]. Terrestrial Arthropod Reviews. 2012, 5(2): 1-15.

[4] 董文濱, 馬蘭婷, 王穎, 等. 意大利蜜蜂春繁、產漿、越冬和發(fā)育階段營養(yǎng)需要建議標準[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2014, 26(2):342-347.

[5] 張金振, 吳黎明, 趙靜, 等. 13種植物源蜂花粉蛋白質的營養(yǎng)學評價[J]. 食品科學, 2014, 35(01): 254-257.

[6] 程尚, 羅文華, 高麗嬌, 等. 酶解改性技術在蜂產品中的應用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2016, (10上): 229-233.

[7] 朱曉麗, 孫麗萍, 董捷. 油菜蜂花粉蛋白酶解條件的研究[J].食品科學, 2008, 29(4): 234-238.

[8] 高鯤, 張紅城, 董捷. 復合蛋白酶酶解油菜蜂花粉及其表征[J]. 食品科學, 2011, 32(20): 99-103.

[9] 李艷伏, 徐懷德, 陳金海, 等. 木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白產物抗氧化活性研究[J]. 中國食品學報, 2008, 8(5): 8-14.

[10] 張海生, 陳錦屏. 蜂蛹蛋白質酶解工藝及其氨基酸口服液對小鼠的強壯作用[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版),2007, 35(1): 100-105.

[11] 郭冬青, 紀付江, 高健, 等. 無花果蛋白酶的不同提取方法比較及酶學性質研究[J]. 湖北農業(yè)科學, 2011, 50(6): 1258-1260.

[12] 張璟晶, 袁敏, 管遠紅, 等. 不同溫度、pH和無機離子對黑曲霉A66菌株產柚苷酶活力影響的初步研究[J]. 江西農業(yè)大學學報, 2006, 28(3): 449-452.

[13] 張偉光, 袁鵬, 尹志紅, 等. 胃-胰蛋白酶水解蜂王漿主蛋白制備血管緊張素轉化酶抑制肽工藝的優(yōu)化[J]. 浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版), 2012, 38(4): 511-518.

[14] 馬宇翔, 楊國龍, 周瑞寶, 等. 菠蘿蛋白酶水解醇法大豆?jié)饪s蛋白的研究[J]. 河南工業(yè)大學學報(自然科學版), 2006,27(5): 43-46.

[15] 郭冬青, 紀付江, 高健, 等. 無花果蛋白酶的不同提取方法比較及酶學性質研究[J]. 湖北農業(yè)科學, 2011, 50(6): 1258-1260.

[16] 王邕, 黎海彬, 白先放, 等. 酶解-溶劑法提取羅漢果中黃酮類物質的研究[J]. 食品科技, 2006, 31(7): 125-127.

[17] 張明春, 解軍波, 李婷, 等. 復合酶法提取酸棗仁黃酮研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 174-177.

[18] 何新益, 符繩慧, 王磊. 水溶性蜂膠的酶解制備工藝優(yōu)化[J]. 農業(yè)工程學報, 2009, 25(2): 280-284.

[19] 張紅城, 董捷, 李春陽, 等. β-葡萄糖苷酶酶解蜂膠黃酮苷的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(11): 332-336.

[20] 戴繼榮, 唐力, 鄧玉林, 等. 生物活性環(huán)糊精衍生化蛋白質的合成[J]. 北京理工大學學報, 2005, 25(4): 369-371.

[21] BRAFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976,72: 248-254.

[22] 孫麗萍, 田文禮, 朱曉麗, 等. 蜂花粉總黃酮檢測方法的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(1): 262-265.

[23] 郝曉霞, 羅明, 余淑嫻. 酶解技術及其應用[J]. 江西科學,2007, 25(3): 355-358.

[24] 許雄, 孫靈霞, 李苗云, 等. 酶解畜禽獸肉的研究進展[J].安徽農業(yè)科學, 2008, 36(9): 3677-3678, 3714.

[25] 谷福根, 高永良, 崔福德. 環(huán)糊精包合物研究進展[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(6): 686-693.

[26]趙海霞，陳浩，田景振.環(huán)糊精包合技術[J]. 山東中醫(yī)雜志, 2000, 19(4): 241-243.

[27] JUN S W, KIM M S, KIM J S, et al. Preparation and characterization of simvastatin/hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complex using supercritical antisolvent (SAS) process[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2007,66(3): 413-421.characterization of simvastatin/hydroxypropylbeta-cyclodextrin inclusion complex using supercritical antisolvent(SAS) process[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2007, 66(3): 413-421.

國家蜂產業(yè)技術體系建設專項（CARS-45-SYZ15）；重慶市基礎與前沿研究計劃項目（cstc2015jcyjA80032）；重慶市基本科研業(yè)務費（16440）

劉佳霖（1988-），男，研究實習員，碩士，研究方向蜜蜂授粉行為學及蜂產品研究。E-mail: liujialin5164@163.com。

程尚（1981-），男，碩士，研究方向為蜜蜂授粉行為學及蜂產品研究。E-mail: chengshang3@126.com。