宏基因組學(xué)技術(shù)在皮膚病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張芙蓉 徐宇 劉洋 楊國(guó)玲

116011大連市友誼醫(yī)院皮膚科（張芙蓉）；大連醫(yī)科大學(xué)（徐宇、劉洋）；大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（楊國(guó)玲）

宏基因組學(xué)技術(shù)在皮膚病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張芙蓉 徐宇 劉洋 楊國(guó)玲

116011大連市友誼醫(yī)院皮膚科（張芙蓉）；大連醫(yī)科大學(xué)（徐宇、劉洋）；大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（楊國(guó)玲）

宏基因組學(xué)（metagenomic）又稱環(huán)境基因組學(xué)（environmental genomics），指不依賴培養(yǎng)直接從微生物的天然環(huán)境中提取微生物基因的遺傳物質(zhì)，對(duì)微生物群體進(jìn)行研究分析，最大限度地挖掘微生物資源。傳統(tǒng)的微生物群落檢測(cè)主要依靠培養(yǎng)，但是菌群的種類多，99.9%培養(yǎng)不成功，且不同的菌種生長(zhǎng)的條件和速度不一，導(dǎo)致無法真實(shí)還原微生物的原始狀態(tài)［1］。宏基因組學(xué)研究與傳統(tǒng)微生物研究方式的最大區(qū)別在于把微生物看成一個(gè)整體，擺脫了對(duì)單個(gè)微生物培養(yǎng)和分離的步驟，直接對(duì)環(huán)境中所有的微生物進(jìn)行研究，進(jìn)而可以全面地對(duì)所有微生物進(jìn)行分析。它包括以下4個(gè)步驟：提取某一環(huán)境樣品所有微生物的基因組DNA；直接測(cè)序探究環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能；構(gòu)建宏基因組文庫；對(duì)文庫進(jìn)行篩選尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及活性代謝產(chǎn)物。目前宏基因組學(xué)技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，比如環(huán)境保護(hù)（氣候、水處理、極端環(huán)境、海洋資源）、石油污染修復(fù)、生物冶金等領(lǐng)域已經(jīng)取得了引人矚目的成果。

一、人類宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)在人體疾病中的研究也有重大發(fā)現(xiàn)，如腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)和數(shù)量失衡與肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病以及腸道炎癥等相關(guān)；陰道菌群失調(diào)與陰道炎、口腔菌群與齲均密切相關(guān)；鼻咽部菌群改變與急性中耳炎、鼻竇炎、口腔炎、上呼吸道感染甚至肺炎等密切相關(guān)；皮膚菌群結(jié)構(gòu)和豐度改變與很多皮膚疾病有關(guān)［2］。在人體的皮膚、胃腸道、鼻腔、腸道等部位定植著大量的微生物，其數(shù)量可達(dá)人體自身細(xì)胞數(shù)的10倍以上［3］。人體微生物在人體內(nèi)起著較為重要的作用，如維持一定的動(dòng)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫及輔助維生素合成等一系列的生理生化反應(yīng)。2007年、2009年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）提出了建立人類微生物組計(jì)劃（Human Microbiome Project，HMP），共同研究人體5個(gè)不同部位（皮膚、鼻孔、口腔、腸道和陰道）的微生物群落特點(diǎn)，并分析其與人類健康和疾病的關(guān)系［4］。

二、宏基因組學(xué)在皮膚病研究中的應(yīng)用

目前與皮膚病有關(guān)的研究主要包括皮膚微生物群落［5］及腸道微生物群落［6］。皮膚正常微生物群落指皮膚表面大量的細(xì)菌、真菌、病毒、衣原體和某些原蟲，形成了獨(dú)特的生態(tài)結(jié)構(gòu)，主要分為放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。根據(jù)菌群的定植特點(diǎn)，通常可以分為常駐菌群和暫住菌群［7］。常駐菌群是指長(zhǎng)期定居在皮膚表面可以自我恢復(fù)的菌群，包括葡萄球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌、不動(dòng)桿菌、馬拉色菌等。暫住菌群指通過接觸，從外界環(huán)境中獲得的一類菌群。常駐菌群在某些條件下也可以轉(zhuǎn)化為致病菌群，正常的皮膚菌群平衡失調(diào)就可能導(dǎo)致皮膚疾病的發(fā)生。腸道菌群約500余種，分為生理性細(xì)菌、條件致病菌、病原菌三種。生理性細(xì)菌即專性厭氧菌，是腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，如雙歧桿菌、類桿菌、優(yōu)桿菌和消化球菌等；條件致病菌為腸道非優(yōu)勢(shì)菌群，如腸球菌、腸桿菌；病原菌多為過路菌，長(zhǎng)期定植的機(jī)會(huì)少，如葡萄球菌、變形桿菌、假單胞菌和韋氏梭菌等。當(dāng)各菌種間比例發(fā)生超出正常范圍的變化，一方面腸黏膜屏障功能可能出現(xiàn)障礙，另一方面腸道免疫系統(tǒng)也可能出現(xiàn)問題，從而誘發(fā)疾病。目前特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）、酒渣鼻的發(fā)病與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。

1.AD：是運(yùn)用宏基因組學(xué)研究的常見皮膚疾病之一，雖然AD是非感染性疾病，但大量實(shí)驗(yàn)表明，其與微生物菌群有關(guān)［5］。目前有假說認(rèn)為AD與皮膚屏障、金黃色葡萄球菌及超敏反應(yīng)有關(guān)［7］。宏基因組學(xué)研究顯示，AD患者在發(fā)病時(shí)與發(fā)病前及治療后相比，葡萄球菌所占比例由35%增到90%，非致病的表皮葡萄球菌數(shù)目也大大增加，且在治療后鏈球菌、丙酸桿菌及棒狀桿菌的數(shù)目較治療前增加。與既往常規(guī)培養(yǎng)相比，宏基因組學(xué)研究結(jié)果更好地展示了菌群整體的變化［8］。這也為進(jìn)一步研究菌群中各細(xì)菌間是如何相互作用提供了研究方向。Bourrain等［9］進(jìn)一步利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究了金黃色葡萄球菌與其他共生菌群的平衡在AD中的相互作用，分別比較了干燥皮損、炎癥皮損及健康皮損處在水療前以及水療第1、10、18天皮膚菌群的改變，得出水療前干燥皮損處較炎癥皮損處金黃色葡萄球菌豐度低，通過18 d水療，病變部位的金黃色葡萄球菌減少，在炎癥及潮濕部位，細(xì)菌微生物的多樣性增加。Seite等［10］利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，同一AD患者皮膚感染部位皮膚葡萄球菌的數(shù)量增加，細(xì)菌的多樣性降低，經(jīng)治療后感染部位與未感染部位的菌群相似。

近年研究認(rèn)為，AD的發(fā)病還與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。宏基因組學(xué)研究腸道菌群顯示，AD患兒在出生后1及12個(gè)月腸道菌群的多樣性降低，出生1個(gè)月以擬桿菌門、屬的多樣性降低，出生后12個(gè)月以變形桿菌門的多樣性降低，根據(jù)嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群的改變可預(yù)測(cè)將來是否發(fā)生AD［6］。進(jìn)一步研究表明，群落多樣性的減少可能導(dǎo)致由非致病性微生物產(chǎn)生的無害抗原對(duì)固有免疫的刺激減少，影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，引起一系列過敏癥狀的出現(xiàn)［11］。West等［12］利用宏基因組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了懷孕期間的孕婦以及出生后1周、1個(gè)月及12個(gè)月嬰兒腸道菌群改變，并評(píng)估了與Toll受體（TLR）-2、4的免疫反應(yīng)的關(guān)系，與對(duì)照組相比，AD患兒出生后1周至1個(gè)月瘤胃球菌屬豐度降低，12個(gè)月腸道菌群表現(xiàn)為放線菌門的α多樣性降低，其母親即孕婦在懷孕期間腸道擬桿菌門的α多樣性降低，推測(cè)這些腸道菌群的豐度降低是因其潛在的免疫調(diào)節(jié)功能激發(fā)炎癥細(xì)胞因子所致。Song等［13］利用宏基因組學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AD患者腸道普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzi）豐度增高，推測(cè)普拉梭菌的比例失調(diào)引起腸道上皮炎癥，從而引發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致AD的發(fā)生。

2.痤瘡：痤瘡好發(fā)于皮脂腺旺盛的部位，主要與嗜脂性的痤瘡丙酸桿菌有關(guān)［14］。采用抗生素治療痤瘡有效也支持這一結(jié)論。Bek-Thomsen等［15］采用宏基因組學(xué)技術(shù)比較了健康人與痤瘡患者的菌群，發(fā)現(xiàn)痤瘡患者毛囊內(nèi)的菌群為表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌及小部分其他菌屬，而健康人毛囊內(nèi)僅有痤瘡丙酸桿菌。這項(xiàng)研究結(jié)果引發(fā)一個(gè)問題：痤瘡丙酸桿菌作為一共生菌是如何變成致病菌、是否與痤瘡丙酸桿菌的菌種不同有關(guān)？目前少數(shù)研究對(duì)這一問題進(jìn)行了解釋。Fitz-Gibbon等［16］比較了49例痤瘡患者與52例健康人鼻部皮脂腺單元的皮膚微生物群，結(jié)果兩組痤瘡丙酸桿菌相對(duì)豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但痤瘡患者中核糖體型4（RT4）和RT5痤瘡丙酸桿菌的菌株占優(yōu)勢(shì)，RT6菌株則主要見于正常人群的鼻部，提示RT4和RT5痤瘡丙酸桿菌菌株與痤瘡的發(fā)病密切相關(guān)，RT6菌株則與健康皮膚相關(guān)。Liu等［17］還對(duì)痤瘡患者皮膚微生物群中的噬菌體做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體與細(xì)菌間的相互作用調(diào)節(jié)著微生物的平衡。這為將來用噬菌體治療痤瘡奠定了基礎(chǔ)。

3.玫瑰痤瘡：既往研究表明，其發(fā)病與蠕形螨有關(guān)。Murillo等［18］利用宏基因組學(xué)技術(shù)比較了毛細(xì)血管擴(kuò)張組、丘疹膿皰組及健康人蠕形螨屬的不同，發(fā)現(xiàn)丘疹膿皰組變形菌門及硬壁菌門數(shù)量增加，放線菌門的數(shù)量減少。后續(xù)研究認(rèn)為，除了蠕形螨，還與幽門螺桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎衣原體、腸道菌群等多種微生物的感染有關(guān)［19-20］。Picardo等［21］進(jìn)一步研究表明，玫瑰痤瘡患者皮膚微生物群落是通過激活人體的固有免疫而導(dǎo)致玫瑰痤瘡的發(fā)生，通過促進(jìn)TLR-2的表達(dá)加重炎癥的產(chǎn)生，腸道細(xì)菌的過度增長(zhǎng)也引起玫瑰痤瘡的發(fā)生，通過去除這些細(xì)菌有利于皮損的好轉(zhuǎn)。

4.疥瘡：疥瘡是疥螨感染所致的傳染性疾病。Pearl等［22］的宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，疥螨感染的豬皮膚上葡萄球菌數(shù)量較正常豬皮膚增多。Mofiz等［23］利用宏基因組學(xué)技術(shù)比較從豬和人身上分離的疥螨線粒體基因組序列，得出兩者僅有很少的遺傳學(xué)不同，這可能是人和動(dòng)物交叉感染的原因。

5.與病毒感染相關(guān)的腫瘤（鱗狀細(xì)胞癌、日光性角化病）：宏基因組學(xué)的研究主要是對(duì)細(xì)菌微生物的研究，對(duì)真菌和病毒的研究相對(duì)少。Hannigan等［24］利用宏基因組學(xué)技術(shù)建立了皮膚的病毒微生物群。Bzhalava等［25］檢測(cè)了82例皮膚鱗癌及60例日光性角化病皮損刮拭標(biāo)本、82例皮膚鱗癌及72例角化棘皮瘤石蠟包埋標(biāo)本以及85例皮膚鱗癌、92例日光性角化病及92例角化性棘皮瘤新鮮冰凍標(biāo)本中病毒感染DNA，在4 284個(gè)病毒克隆子中，4 168個(gè)為人乳頭瘤病毒（HPV）相關(guān)，其中15個(gè)為已知亞型（HPV8、HPV12、HPV20、HPV36、HPV38、HPV45、HPV57、HPV59、HPV104、HPV105、HPV107、HPV109、HPV124、HPV138、HPV147），4個(gè)為以前報(bào)道過的亞型（HPV 915 F 06 007 FD1、FA73、FA101、SE42），2個(gè)為新的亞型（SE46、SE47）。其他學(xué)者的研究也表明，宏基因組學(xué)技術(shù)能很好地鑒定HPV感染亞型［26-27］。

6.銀屑?。恒y屑病是一種由多基因遺傳、多環(huán)境因素刺激的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病。文獻(xiàn)報(bào)道，銀屑病的發(fā)病與金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌有關(guān)［28-29］，化膿性鏈球菌抗原或超抗原通過免疫反應(yīng)誘發(fā)銀屑?。?9］。Gao等［30］采用宏基因組學(xué)方法比較了6例銀屑病患者皮損處與外觀正常皮膚處菌群的變化，發(fā)現(xiàn)在皮損處最主要的優(yōu)勢(shì)群落是硬壁菌門，比外觀正常皮膚和健康人皮膚增高；放線菌及丙酸桿菌屬顯著減少。Fahlén等［31］也采用宏基因組學(xué)方法比較了10例銀屑病患者皮損處與12例正常人皮膚的菌群結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示，銀屑病患者皮損處變形菌的比例較健康人皮膚明顯增加，葡萄球菌和丙酸桿菌含量則顯著低于健康人皮膚，且鏈球菌屬的比例不同，其中銀屑病皮損處占32%，而健康對(duì)照為26%。這些研究提示，銀屑病皮損菌群結(jié)構(gòu)有別于健康人皮膚。而在一項(xiàng)針對(duì)銀屑病皮損部位真菌群落的分析研究中，應(yīng)用馬拉色菌種特異性引物建立rRNA基因的克隆文庫，結(jié)果顯示，正常人與銀屑病患者皮損中的真菌群落分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示皮膚馬拉色菌群落特征可能更多和宿主個(gè)體有關(guān)，在銀屑病發(fā)病中的影響甚微［32］。以上研究結(jié)果表明，細(xì)菌與真菌微生物群落的變化與銀屑病的關(guān)系尚不肯定，有待于更深入的研究。

7.頭皮屑：既往認(rèn)為頭皮屑和脂溢性皮炎是同一病譜疾病。馬拉色菌感染被認(rèn)為是導(dǎo)致頭皮屑的重要因素。新近研究認(rèn)為，頭皮屑不僅與真菌有關(guān)，可能還與頭皮表面微生態(tài)的失衡有關(guān)。頭皮的微生物群主要由細(xì)菌和真菌等組成，主要包括葡萄球菌、丙酸桿菌和馬拉色菌［33］。法國(guó)學(xué)者Clavaud等［34］利用宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，頭皮屑患者與健康人微生物群落不同，主要表現(xiàn)在痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌和限制性馬拉色菌的不同，頭皮屑患者的限制性馬拉色菌和表皮葡萄球菌數(shù)目增加，痤瘡丙酸桿菌卻顯著減少，且同一個(gè)體的頭皮屑部位與正常部位相比也存在這一差異，表明頭皮屑與頭皮表面的微生物菌群平衡有關(guān)。我國(guó)學(xué)者也利用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)中國(guó)的頭皮屑患者做了類似的研究，得出與Clavaud等同樣的結(jié)論［35］。Park等［36］的研究表明，頭皮屑患者頭皮的主要真菌為擔(dān)子菌門，而正常人頭皮常見的真菌為子囊菌門。

8.慢性傷口：正常傷口的修復(fù)在3～14 d完成，但對(duì)于糖尿病、老年人、臥床者、免疫性疾病患者等的皮膚傷口，由于皮膚組織出血、壞死，含氧量低，易于細(xì)菌大量繁殖，引發(fā)持續(xù)的慢性炎癥，使傷口難以愈合。應(yīng)用常規(guī)培養(yǎng)和宏基因組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，慢性傷口處皮膚微生物的多樣性較正常皮膚明顯［37］。Gardner等［38］利用宏基因組學(xué)技術(shù)分析了糖尿病足皮膚潰瘍微生物與臨床癥狀的關(guān)系，得出潰瘍的深度與厭氧菌的數(shù)量有關(guān)，與葡萄球菌的數(shù)量無關(guān)；潰瘍持續(xù)的時(shí)間與細(xì)菌的豐度、變形菌門的數(shù)量有關(guān)，與葡萄球菌的數(shù)量無關(guān)。Sprockett等［39］分析了靜脈曲張患者腿部潰瘍?cè)谥委熯^程中每周微生物定植的數(shù)量、菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的改變，結(jié)果顯示，在治療前、治療中及治愈后這3個(gè)階段菌群表現(xiàn)有極大不同。

9.腋臭：腋臭的發(fā)病除了與頂泌汗腺的分泌、遺傳等有關(guān)，腋部微生物群成為發(fā)病機(jī)制研究的另一方向。傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)認(rèn)為，腋部微生物主要包括葡萄球菌類、微球菌類和棒狀桿菌屬、丙酸桿菌屬。其中棒狀桿菌被認(rèn)為是腋臭主要的致病原［40］。Callewaert等［41］采用宏基因組學(xué)技術(shù)觀察了53例健康人腋部微生物群落的特點(diǎn)，得出腋部菌群主要為葡萄球菌及棒狀桿菌，女性以葡萄球菌為主，男性以棒狀桿菌為主，每個(gè)個(gè)體的腋部微生物菌群不同，左右腋窩菌群相同的約占一半。腋部菌群相對(duì)穩(wěn)定，除臭劑影響腋部菌群的多樣性。Troccaz等［42］采用宏基因組學(xué)技術(shù)比較了13例使用除汗劑（女7例、男6例）及11例未使用除汗劑（女6例、男5例）的腋部菌群，得出與上述研究類似的結(jié)論：未使用除汗劑的腋部微生物菌群以硬壁菌門及放線菌門為主，其中96%的為葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬及丙酸桿菌屬；男、女腋部菌群不同，棒狀桿菌與體味有關(guān)，丙酸桿菌與體味無關(guān)。

10.癌癥惡病質(zhì)：這雖不是皮膚科一種常見疾病，但對(duì)于皮膚腫瘤晚期患者也存在癌癥惡病質(zhì)現(xiàn)象。Li等［43］比較了癌癥惡病質(zhì)患者與健康人皮膚微生物群落的不同，得出癌癥惡病質(zhì)患者菌群的豐度降低，且棒狀桿菌的數(shù)量明顯減少。這一結(jié)論對(duì)于微生物群落與癥狀間的聯(lián)系有預(yù)見作用。

三、結(jié)語

宏基因組學(xué)在皮膚病研究中的應(yīng)用揭示了令人驚訝的微生物群落與疾病的關(guān)系，隨之而來許多問題也擺在我們的面前：除了皮膚及腸道的菌群與某些皮膚病有關(guān)，其他部位的菌群失調(diào)是否也與皮膚病有關(guān)？這些菌群變化與疾病的發(fā)生有何聯(lián)系？縱觀上述幾類疾病，宏基因組學(xué)研究適用于微生物群落的研究，除了感染性疾病，非感染性疾病中哪些疾病適用于該方法來研究？這也是一個(gè)值得思考的問題。目前因菌群之間相互作用的機(jī)制尚不明確，限制了將該技術(shù)應(yīng)用于皮膚病的診斷、治療和預(yù)后。已有的研究?jī)H僅是宏基因組學(xué)在皮膚病應(yīng)用的開端，有很多研究有待更深入的探索。

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2017中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)將于4月在珠海召開

經(jīng)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)定于2017年4月20-24日在珠海維景國(guó)際大酒店召開中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)。此次會(huì)議將發(fā)揚(yáng)歷次年會(huì)的優(yōu)良傳統(tǒng)，注重中西醫(yī)結(jié)合治療皮膚病的新方法及新的研究進(jìn)展等方面的學(xué)術(shù)交流，內(nèi)容密切聯(lián)系臨床，切合皮膚科醫(yī)師的實(shí)際需求，會(huì)議將邀請(qǐng)知名專家做特邀演講，闡述皮膚科相關(guān)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，創(chuàng)造形式多樣、內(nèi)容充實(shí)、緊張熱烈、活躍互動(dòng)的學(xué)術(shù)交流形式，達(dá)到全國(guó)皮膚科中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師共同展現(xiàn)才華、獲取知識(shí)和信息、增進(jìn)友誼的目的。

聯(lián)系方式：上海市黃浦區(qū)成都北路500號(hào)峻嶺廣場(chǎng)19樓1908室，上海長(zhǎng)征醫(yī)院《中國(guó)真菌學(xué)雜志》編輯部，郵編：200003，Email：pfkxh@126.com，聯(lián)系人：施慧，021-81885497，手機(jī)：13764560811。

楊國(guó)玲，Email：yanggl@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.021

2016-06-20）

（本文編輯：顏艷）