Ras1、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達(dá)差異

陳珊珊 周劍峰 廖勇 李海濤 王瑞麗 巴根 呂雪蓮 楊蓉婭

100700北京，解放軍陸軍總醫(yī)院皮膚科

Ras1、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達(dá)差異

陳珊珊 周劍峰 廖勇 李海濤 王瑞麗 巴根 呂雪蓮 楊蓉婭

100700北京，解放軍陸軍總醫(yī)院皮膚科

目的研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達(dá)差異，探討其在菌絲生長過程中的作用。方法分別培養(yǎng)阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相，提取兩組的總RNA，采用熒光定量PCR方法測定兩組中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果酵母相菌絲生成率（0.40%±0.53%）顯著低于菌絲相（99.33%±0.57%，t=13.93，P＜0.05）。實時熒光定量PCR顯示，以酵母相為對照組，將其Ras1、Rac1、Rho1基因表達(dá)量均設(shè)為1，則菌絲相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相對表達(dá)量分別為25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50，與酵母相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為3.81、3.51、3.90，均P＜0.05）。結(jié)論Ras1、Rac1、Rho1基因可能參與了阿薩希毛孢子菌菌絲的生長過程。

毛孢子菌屬；單體GTP結(jié)合蛋白質(zhì)類；阿薩希毛孢子菌；Ras1；Rac1；Rho1；酵母相；菌絲相

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是一種條件致病真菌，在細(xì)胞形態(tài)上可表現(xiàn)為酵母樣芽生孢子、關(guān)節(jié)孢子、真菌絲和假菌絲。真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換在其生長、播散感染中發(fā)揮重要作用，其中酵母相與菌絲相間的相互轉(zhuǎn)換關(guān)系復(fù)雜，而這種轉(zhuǎn)換對其環(huán)境適應(yīng)和毒力都有重要影響［1-3］。Ras超家族蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，主要包括Ras、Rab、Arf、Rho和Ran 5個亞家族，具有GTP酶活性，在形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控通路中起重要作用。Rac1和Rho1作為Rho家族蛋白的重要成員，在真菌極性生長中發(fā)揮重要作用［4］。有研究顯示［5］，Rho家族蛋白成員Cdc42在T.asahii的菌絲相中的表達(dá)明顯高于酵母相，很可能參與T.asahii菌絲的生長。本研究采用熒光定量PCR檢測Ras1、Rac1、Rho1 mRNA在T.asahii酵母相和菌絲相中的表達(dá)水平，以了解Ras1、Rac1、Rho1基因與T.asahii菌絲形成的關(guān)系。

一、材料和方法

1.實驗菌株、試劑和儀器：T.asahii標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479，購自荷蘭皇家藝術(shù)與科學(xué)學(xué)院真菌多樣性研究中心（CBSKNAW）。酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖）、玉米培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限公司），RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），Trizol試劑（美國Sigma公司），cDNA第1鏈合成試劑盒（美國Invitrogen公司），熒光定量PCR檢測試劑盒（美國ABI公司），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HIQ-E雙層空氣恒溫振蕩器（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），NanoDrop2000分光光度計（美國Thermo Scientific公司），LightCyler 480熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

2.T.asahii酵母相、菌絲相的培養(yǎng)及觀察：將YPD斜面生長48 h的T.asahii標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479接種于YPD液體培養(yǎng)基，密度調(diào)整為5.0×106/ml，置搖床25℃振蕩培養(yǎng)24 h，1 500×g離心5 min，棄上清液，以無菌去離子水洗滌并調(diào)整細(xì)胞密度至5.0×108/ml。取200 μl高濃度菌液，加入4.8 ml無菌水稀釋，分別取1 ml稀釋液平鋪于5個直徑為90 mm玉米固體培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)5 d，以獲得酵母相；取200 μl高濃度菌液接種于1個50 ml RPMI1640液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，以獲得菌絲相［5］。

從玉米培養(yǎng)基上刮取適量菌落，從液體培養(yǎng)基中取10 μl菌懸液，均于光鏡下（×200），在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)100個細(xì)胞中形成菌絲的細(xì)胞數(shù)，得出百分?jǐn)?shù)。重復(fù)試驗3次。以菌絲長度為孢子直徑3倍以上者作為菌絲計數(shù)［6］。

3.T.asahiiRNA提取及反轉(zhuǎn)錄：收集菌懸液，離心，棄上清液，用去離子水重新懸浮，洗滌2遍，棄上清液，置于研缽中加入適量液氮研磨，在液氮未完全揮發(fā)前加入1 ml Trizol RNA提取試劑，按Trizol法提取總RNA，干燥后加入DEPC水20 μl溶解。用分光光度計測量提取的總RNA濃度和純度，并電泳測量RNA完整性。取純度和完整性較好的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個樣品取總RNA 2 μg，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成第1鏈cDNA，反應(yīng)條件：42℃20 min、95℃3 min，冰上冷卻后置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

4.T.asahiiRas1、Rac1、Rho1基因熒光定量PCR反應(yīng)：采用熒光定量PCR檢測試劑盒按照說明書進(jìn)行操作。配置PCR擴(kuò)增體系（總體積20 μl）：1× Power SYBRgreen PCR Master Mix 10 μl、ddH2O 8 μl、待擴(kuò)增基因的上下游引物各0.5 μl、模板cDNA 1 μl。擴(kuò)增反應(yīng)在Roche 480型熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min；變性95℃15 s，退火/延伸60℃1 min，40個循環(huán)；60～ 95℃進(jìn)行熔解曲線分析，每10 s升高1℃。基因的上、下游引物和退火溫度見表1，18S RNA為內(nèi)參照。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)管，重復(fù)試驗3次。分別測定酵母相和菌絲相中Ras1、Rac1、Rho1基因及內(nèi)參基因18S RNA的Ct值，試驗結(jié)果取其均值，按照2-△△Ct相對定量公式計算菌絲相相對于酵母相的各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其中△△Ct=（菌絲相目的基因平均Ct值-菌絲相內(nèi)參基因平均Ct值）-（酵母相目的基因平均Ct值-酵母相內(nèi)參基因平均Ct值）。

5.統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.T.asahii酵母相和菌絲相的形態(tài)觀察及菌絲生成率比較：T.asahii標(biāo)準(zhǔn)株于玉米培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)5 d，鏡下觀察可見大量關(guān)節(jié)孢子及芽生孢子，基本為酵母相，菌絲生成率為0.40%±0.53%；而于RPMI1640培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，鏡下觀察可見大量細(xì)長菌絲，可見分枝，菌絲間可相互纏繞，基本為菌絲相，菌絲生成率為99.33%±0.57%，兩者菌絲生成率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.93，P＜0.05）。

2.Ras1、Rac1、Rho1基因在酵母相和菌絲相中的表達(dá)：實時熒光定量PCR顯示，目的基因和內(nèi)參基因的熔解曲線峰均為單一峰形且峰形銳利，未見其他峰值。擴(kuò)增曲線均光滑平穩(wěn)，熒光吸收圖譜的S形曲線形狀完整，符合定量檢測要求。相對定量分析顯示，以酵母相為對照組，將其Ras1、Rac1、Rho1基因表達(dá)量均設(shè)為1，則菌絲相mRNA相對表達(dá)量分別為25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50，與酵母相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為3.81、3.51、3.90，P＜ 0.05）。

表1 各基因上下游引物及退火溫度

三、討論

真菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控通路和相關(guān)基因復(fù)雜，而Ras超家族蛋白則是其中的重要成員，其中Ras1基因在真菌生長過程中發(fā)揮重要作用。例如在釀酒酵母中，Ras1同源蛋白通過cAMP/PKA、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Rho蛋白系統(tǒng)，參與細(xì)胞周期、假菌絲生長和壓力應(yīng)答力等多項細(xì)胞進(jìn)程［7-8］，與其在白念珠菌中的作用類似。在白念珠菌中，Ras1蛋白通過cAMP/PKA通路來調(diào)控酵母形態(tài)、壓力應(yīng)答、細(xì)胞黏附和交配［9］。白念珠菌不僅能形成酵母和假菌絲的形態(tài)，還能生成真菌絲，而這種酵母-菌絲的菌相轉(zhuǎn)換也是由Ras1蛋白通過cAMP/PKA和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)［9］。在總狀毛霉的萌芽和菌絲生長階段，Ras1都有大量表達(dá)，且活性Ras1能增高萌芽期的生長率［10］。此外，Rac1和Rho1是Rho家族蛋白的重要成員，在真菌極性生長過程中也發(fā)揮重要作用。Hurtado等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在解脂亞羅酵母中Rac1基因從酵母相轉(zhuǎn)化為菌絲相時表達(dá)量顯著提高。在玉蜀黍黑粉菌和麥角菌中，Rac1的缺失會破壞菌絲的極性生長［12-13］。在裂殖酵母、粗糙脈孢霉、白念珠菌、構(gòu)巢曲霉等真菌細(xì)胞中，Rho1與細(xì)胞極性生長、細(xì)胞壁合成等活動直接有關(guān)［14-19］。Harris［20］發(fā)現(xiàn)，在黑曲霉中，Rho1突變株可影響細(xì)胞出芽生長。本研究中Ras1、Rac1、Rho1基因在T.asahii酵母相和菌絲相均有表達(dá)，但在菌絲相中的mRNA相對表達(dá)量均顯著高于酵母相，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Ras1、Rac1、Rho1基因并非菌絲特異基因，但參與了細(xì)胞極性生長和酵母相轉(zhuǎn)換成菌絲相的生理過程。

綜上，Ras家族蛋白的代表成員Ras1、Rac1、Rho1與T.asahii生長有密切聯(lián)系，在不同真菌形態(tài)轉(zhuǎn)換中起到了很大作用。但這還需要進(jìn)一步的實驗研究來驗證，如基因敲除、基因沉默等。這些基因在T.asahii菌絲生長過程中的具體調(diào)控機(jī)制及與致病性之間的關(guān)系也需深入的探討。

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中國麻風(fēng)史料陳列館、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所史料陳列館征集文物和史料啟事

為真實記載中國麻風(fēng)防治的發(fā)展歷程，全方位展現(xiàn)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院、研究所（簡稱院所）60余載的歷史變革和文化積淀，傳承和發(fā)揚老一輩無私奉獻(xiàn)的精神，院所決定籌建中國麻風(fēng)史料陳列館、院所史料陳列館。即日起，面向社會各界廣泛征集具有歷史價值的文物和史料。

一、征集范圍

1.反映院所各歷史時期發(fā)展沿革、重大活動、科研成就、領(lǐng)導(dǎo)關(guān)懷及院所職工參加國內(nèi)外重大活動等方面的重要文獻(xiàn)、題詞、圖片、新聞報道、手稿、徽標(biāo)、紀(jì)念冊、音像制品、獎狀、證書等。

2.國家領(lǐng)導(dǎo)人、社會知名賢達(dá)及重要外賓、杰出校友來院所參觀、考察、訪問或演講時的題詞、圖片、新聞報道、音像制品等。

3.各類皮膚性病、麻風(fēng)防治的圖片、圖表及文字說明，醫(yī)、教、研、防、管等領(lǐng)域工作中使用過的辦公用品、儀器設(shè)備、書籍教案、教學(xué)工具等實物。

4.反映中國麻風(fēng)防治歷程及成就，麻風(fēng)受累者的醫(yī)療及生活狀況等有歷史價值的文物和史料。

二、征集方式及要求

1.文物和史料的征集采用捐贈、代管、借用等方式。

2.所有文物和史料請?zhí)峁┪淖终f明，含來源、史料載體、形成時間及其所涉及的人物、事件等要素。

3.文物和史料的征集歡迎直接送達(dá)；亦可通過電子傳送、信函郵寄、預(yù)約拜訪、登門征集等途徑進(jìn)行。

4.征集的文物和史料，均登記入冊；一經(jīng)采用，除在史館陳列時標(biāo)注捐贈者的姓名外，將授贈榮譽證書。

5.征集時間：長期征集。

三、聯(lián)系方式

聯(lián)系人：210042，南京玄武區(qū)蔣王廟街12號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中心辦公室（科研樓415室）諸萍，電話：025-85478032，傳真：025-85424903，Email：zhup@ncstdlc.org。

《中國皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》征文及研修班招生

為了系統(tǒng)總結(jié)我國皮膚性病學(xué)文獻(xiàn)及介紹做出重要貢獻(xiàn)的著者，廖萬清院士、禤國維國醫(yī)大師領(lǐng)銜編輯《中國皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》。凡為該書提供書目及著者傳略者、向籌建的中國皮膚科博物館贈送文物者，可獲贈《中國皮膚科學(xué)史》（600元）1冊。

為推廣我國政策規(guī)定的外用中藥臨方調(diào)劑、中醫(yī)中藥療法，2017年繼續(xù)舉辦全國皮膚美容化妝品制劑研修班，馬振友、李斌傳授實用處方，示教實習(xí)，學(xué)會為止。劉巧、劉紅霞等名中醫(yī)傳授示教火療、火針、臍療、薰蒸、煙薰、熨烙、鮮藥、刺絡(luò)拔罐、太乙神針等實用療法，學(xué)員互教互學(xué)。報名注冊者獲贈《皮膚美容化妝品制劑手冊》和《皮膚病中醫(yī)方劑制劑手冊》各1冊。贈送臨方調(diào)配乳膏基質(zhì)及蒼龍嶺牌等皮膚外用產(chǎn)品試用。對索取征文及招生信息和獲取試用藥品者，來函必復(fù)、必贈。

陜西馬振友藥業(yè)有限公司，手機(jī)/微信：13227015533，13379033002；QQ：386966727。

Differences in expression of Ras1,Rac1 and Rho1 genes between yeast and hyphal phases of Trichosporon asahii

Chen Shanshan,Zhou Jianfeng,Liao Yong,Li Haitao,Wang Ruili,Ba Gen,Lyu Xuelian,Yang Rongya
Department of Dermatology,General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100700,China

s:Yang Rongya,Email:yangrya@sina.com;Lyu Xuelian,Email:mycoses@gmail.com

ObjectiveTo investigate differences in the expression of Ras1,Rac1 and Rho1 genes between yeast and hyphal phases ofTrichosporon asahii（T.asahii）,and to explore their roles in the formation of hyphae.MethodsThe yeast phase and hyphal phase ofT.asahiiwere cultured and served as yeast phase group and hyphal phase group respectively.Total RNA was extracted from the 2 groups,and real-time fluorescence-based quantitative PCR（RT-PCR）was performed to measure the mRNA expression of Ras1,Rac1 and Rho1.ResultsThe hyphal formation rate was significantly lower in the yeast phase group than in the hyphal phase group（0.40% ±0.53%vs.99.33% ±0.57%,t=13.93,P＜0.05）.When the mRNA expression of Ras1,Rac1 and Rho1 in the yeast phase group was all set as 1,that in the hyphal phase group was 25.17±10.99,16.81±7.80,42.61±18.50,respectively,with significant differences between the two groups in the three parameters（t=3.81,3.51,3.90,respectively,allP＜ 0.05）.ConclusionRas1,Rac1 and Rho1 genes may participate in the regulation of hyphal formation inT.asahii.

Trichosporon;Monomeric GTP-binding proteins;Trichosporon asahii;Ras1;Rac1;Rho1;Yeast phase;Hyphal phase

楊蓉婭，Email：yangrya@sina.com；呂雪蓮，Email：mycoses@gmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.013

國家自然科學(xué)基金（81471928、81571972）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81471928,81571972）

2016-05-11）

（本文編輯：周良佳 顏艷）