皮膚的光-污染物應(yīng)激：UVA1和空氣污染物協(xié)同破壞角質(zhì)形成細(xì)胞氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究

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皮膚的光-污染物應(yīng)激：UVA1和空氣污染物協(xié)同破壞角質(zhì)形成細(xì)胞氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究

近年來，隨著人們對污染物危害認(rèn)識（心肺疾病等）的不斷加深，人們對環(huán)境空氣污染的研究興趣也在日益增加，但空氣污染與皮膚健康的相關(guān)研究則相對有限。近期，有臨床數(shù)據(jù)表明，空氣污染物中的超細(xì)顆粒物（UFP）可通過加劇皮膚炎癥反應(yīng)來加重特應(yīng)性皮炎患者的病情。歐萊雅在墨西哥展開的一項(xiàng)臨床研究表明：空氣污染可導(dǎo)致皮膚屏障功能下降、皮脂分泌量增加以及皮脂成分改變等，但迄今對皮膚健康影響的具體機(jī)制仍不清楚。原因之一是空氣中的污染物種類繁多，難以逐一檢測。

如今我們都知道“顆粒物（PM）”這個概念，主要由工業(yè)活動產(chǎn)生，一般直徑大于幾微米，例如，PM10（中值尺寸約為10 μm），通常含有一些礦物質(zhì)成分，包括各種金屬等。而來自木材/煤炭燃燒和柴油燃燒廢氣的顆粒物的粒徑則較小，例如，PM2.5（中值尺寸約為2.5 μm）和超細(xì)顆粒物（直徑＜100 nm）。這些細(xì)小的顆粒物能夠攜帶重金屬和多環(huán)芳烴（PAH）等有毒物質(zhì)，成為空氣污染主要的有害組成。

到目前為止，PM對皮膚健康的影響未有詳細(xì)描述，而真實(shí)污染環(huán)境中，人體皮膚的PAH水平也未見發(fā)表。污染物除了能夠直接接觸皮膚，還能夠通過系統(tǒng)途徑（食物、呼吸）進(jìn)入體內(nèi)并通過血液循環(huán)重新到達(dá)皮膚。有研究測量，單人每天可通過食物約攝入3.7 mg的PAH。富含PAH的超細(xì)顆粒物能夠沉積在肺泡中，通過上皮屏障轉(zhuǎn)移到肺部的毛細(xì)血管內(nèi)。一項(xiàng)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，煤煙上吸附的BaP（一種PAH）在被人體吸入后，1 h內(nèi)即可進(jìn)入血液循環(huán)，其危害可持續(xù)數(shù)周。目前檢測到的血清內(nèi)致癌化合物（如BaP代謝產(chǎn)物）平均濃度都在納摩爾范圍內(nèi)。另外一些研究人員關(guān)于尿液里和毛干內(nèi)PAH代謝物的定量和定性的評估研究也進(jìn)一步提示和強(qiáng)調(diào)了環(huán)境污染物還可能從體內(nèi)對皮膚進(jìn)行傷害。此外，具有UVA光反應(yīng)性的一些PAH還能夠加劇顆粒物對皮膚的損傷。事實(shí)上，早在幾十年前就有研究發(fā)現(xiàn)了PAH體外的光毒性，特別是BaP。近期報道，長波UVA（UVA1：340～400 nm）可誘導(dǎo)皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激或DNA損傷等多種傷害。也有學(xué)者觀察到，UVA1還能特異性誘導(dǎo)MMP-12（彈性蛋白酶）合成上調(diào)，表明該波段與皮膚光老化聯(lián)系緊密。另外微量PAH的光活化還可加重UVA1所誘導(dǎo)的皮膚氧化應(yīng)激。

該研究旨在了解人角質(zhì)形成細(xì)胞在體外同時接觸PAH（環(huán)境污染物替代模型）和日光照射會涉及到的一些環(huán)境應(yīng)激相關(guān)機(jī)制。該研究所使用的PAH濃度與報道的人血液內(nèi)實(shí)際PAH濃度相似。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中所用的PAH濃度是在納摩爾范圍內(nèi)，且研究中使用的UVA1照射劑量都相當(dāng)于日光中UVA1的劑量。

一、材料和方法

參見原文。

二、結(jié)果

1.日常UV（或UVA1）和PM（或顆粒物提取物PME或PAH）協(xié)同作用誘發(fā)細(xì)胞光毒性的比較：該研究選擇的UVA1波段為350～400 nm。研究比較了7.5 J/cm2的dUV或UVA1照射下PM和PME對角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞光毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PME和PM細(xì)胞光毒性的最低濃度分別為1.9 mg/ml和25 mg/ml。PME較強(qiáng)的細(xì)胞光毒性可能反映了PAH的組成及其生物利用度。已知PME對UVB和UVA2的吸收率較高，但日光中各波段對細(xì)胞的存活率影響卻都相似。所以，可推測UVA1是導(dǎo)致研究中角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞光毒性的主要原因，究其原因可能是UVA1的光譜波段可激發(fā)幾種具有光反應(yīng)性的化學(xué)物質(zhì)。

研究還對一些常見的PAHs（如菲、熒蒽、二苯并蒽、BaP和IcdP）進(jìn)行了UV照射試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對UVB/UVA有同樣吸收能力的BaP和IcdP與UVA1協(xié)同作用，在極低濃度下即可導(dǎo)致細(xì)胞的光毒性（相比其他幾種PAH），且比與dUV協(xié)同作用強(qiáng)度更大。由于BaP和IcdP是納摩爾級的光敏劑，因此可以解釋PM和PME的UVA1光毒性?？紤]到MTT Assay取決于細(xì)胞代謝的活性，因此研究使用細(xì)胞計(jì)數(shù)來作為細(xì)胞光毒性的第二指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與MTT數(shù)據(jù)一致。除了上述單層細(xì)胞培養(yǎng)所觀察到的結(jié)果，研究還求證了在體外重建皮膚模型中該結(jié)果的重現(xiàn)情況。證實(shí)在多次照射方案下，低濃度的BaP和IcdP同樣會引起體外重建表皮模型的細(xì)胞光毒性。與此同時，在體外重建表皮模型的培養(yǎng)基內(nèi)加入BaP和IcdP后進(jìn)行UVA1照射，還能檢測到與照射劑量呈正相關(guān)的組織損傷，特別是在基底層上層。該結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，在UVA1的協(xié)同作用下，皮膚深層的角質(zhì)形成細(xì)胞對BaP和IcdP的系統(tǒng)性暴露（通過血液循環(huán)等）可能會破壞表皮的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

研究人員還希望了解當(dāng)PAH+UVA1協(xié)同作用未致細(xì)胞死亡的時候，該協(xié)同應(yīng)激是否會破壞角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。于是使用集落形成效率測試（CFE）來進(jìn)行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BaP會損傷角質(zhì)形成細(xì)胞的CFE（IcdP的影響較弱）但不會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。事實(shí)上，5 nmol/L的BaP和UVA1協(xié)同作用角質(zhì)形成細(xì)胞所長出的細(xì)胞集落雖然與空白對照組的數(shù)量相似，但細(xì)胞集落的大小卻明顯較小，提示細(xì)胞的增殖能力受損。5nmol/L的IcdP結(jié)果也與其相似。因此，BaP和IcdP與UVA1共同處理角質(zhì)形成細(xì)胞可能破壞表皮的更新。50 nmol/L（細(xì)胞光毒性劑量）的BaP或IcdP作用能夠顯著降低細(xì)胞克隆的集落數(shù)量，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。更重要的是，HPLC/熒光染色分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞光毒性相關(guān)的BaP或IcdP濃度遠(yuǎn)低于預(yù)期（小于理論濃度20%），可能是由PAH-plastic相互作用導(dǎo)致。該結(jié)果表明，研究所檢測的BaP和IcdP光毒性濃度范圍與文獻(xiàn)中報道的血漿內(nèi)濃度一致，并且更低。

2.線粒體參與BaP和IcdP誘導(dǎo)的光氧化應(yīng)激過程：據(jù)報道，PAH的光反應(yīng)產(chǎn)物是各種活性氧簇（ROS），另外UFP能通過細(xì)胞攝入損傷線粒體。歐萊雅早前的臨床研究顯示：生活在空氣污染較重地區(qū)的居民其角質(zhì)層細(xì)胞內(nèi)ATP的含量會減少（相比較輕的空氣污染環(huán)境）。因此，研究也檢測了極低濃度的PAH是否會誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激。事實(shí)上，研究在照射后能立刻觀察到DHR-123探針?biāo)l(fā)出的強(qiáng)熒光，說明BaP和IcdP能夠增強(qiáng)UVA1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。此外，還檢測到線粒體膜的去極化（MMD）和線粒體內(nèi)超氧化物的產(chǎn)生，而在暗室中單獨(dú)加入PAH或單獨(dú)使用UVA1照射都不會產(chǎn)生上述結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）。有意義的是，相比IcdP+UVA1，BaP+UVA1對MMD和超氧化物的產(chǎn)生的影響并不顯著，但對ATP合成的影響較強(qiáng)。這些結(jié)果表明，低濃度的兩種PAHs能夠催化UVA1照射下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；同時還提示它們可能會有針對性的導(dǎo)致線粒體損傷，但BaP和IcdP對線粒體的損傷機(jī)制可能不同。

3.BaP/IcdP±UVA1激發(fā)谷胱甘肽的代謝反應(yīng)：還原型谷胱甘肽（GSH）在細(xì)胞氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，特別是在線粒體內(nèi)。另外它會參與PAH在體內(nèi)的解毒過程。研究在PAH+UVA1協(xié)同作用角質(zhì)形成細(xì)胞的條件下，追蹤檢測細(xì)胞內(nèi)GSH的水平。隨BaP或IcdP濃度的增加，觀察到UVA1照射后5 h細(xì)胞內(nèi)GSH水平呈顯著且緩慢降低，18 h后GSH又恢復(fù)初始水平。為了進(jìn)一步評估GSH對細(xì)胞的保護(hù)作用，在接受PAH+UVA1處理前，對NHEK進(jìn)行丁硫氨酸亞砜氨酸（BSO）預(yù)處理，BSO是GSH生物合成的抑制劑。發(fā)現(xiàn)BSO預(yù)處理能夠顯著減少UVA1+BaP（3 nmol/L和6 nmol/L）和UVA1+IcdP（15 nmol/L和30 nmol/L）處理后角質(zhì)形成細(xì)胞的活力，而單獨(dú)的UVA1照射不會影響B(tài)SO預(yù)處理后細(xì)胞的活力。這個結(jié)果突出了GSH可能對PAH+UVA1誘導(dǎo)的NHEK細(xì)胞光毒性應(yīng)激起防護(hù)作用。研究還檢測了與GSH內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)，來了解細(xì)胞如何應(yīng)對氧化還原狀態(tài)的改變。谷氨酰半胱氨酸連接酶的催化劑（GCLc）和修飾子亞基（GCLm）調(diào)控GSH的新合成，谷胱甘肽還原酶（GR）可再產(chǎn)生氧化型GSH，溶質(zhì)載體家族成員SLC7A11能夠編碼控制細(xì)胞內(nèi)提供胱氨酸的逆向運(yùn)轉(zhuǎn)器。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UVA1照射后5 h BaP或IcdP的存在可顯著誘導(dǎo)SLC7A11基因表達(dá)，18 h后該基因表達(dá)減弱（BaP濃度為6 nmol/L和IcdP濃度為30 nmol/L時的結(jié)果除外），BaP+UVA1的作用導(dǎo)致了持久地高表達(dá)。SLC7A11蛋白也是過度表達(dá)，GCLc的表達(dá)也受到了輕度刺激，而GCLm和GR則未觀察到變化。

三、討論

該體外研究旨在調(diào)查空氣污染物和日光照射對皮膚的協(xié)同影響。首先，研究選用UVA1作為日光照射波段是因?yàn)閁VA1約占日光紫外線的80%，不受云層、衣物或玻璃等阻隔，能夠到達(dá)真表皮層，且全年不同時段和不同緯度的照射能量都相對穩(wěn)定。另外，研究還使用了納摩爾水平的PAHs來模擬一些空氣污染物對皮膚所造成的潛在危害。研究表明，PM、PME和一些PAHs能夠誘導(dǎo)皮膚顯著的光毒性應(yīng)激，且UVA1所誘導(dǎo)的光毒性基本等同于UVB+UVA的合并波段。研究發(fā)現(xiàn)，BaP和IcdP在低濃度（nmol/L）下即能表現(xiàn)出極高的細(xì)胞光毒性。雖然這種低濃度不會影響細(xì)胞的存活率，但其誘導(dǎo)的應(yīng)激能減小細(xì)胞克隆的表面積，影響細(xì)胞的克隆形成能力。結(jié)果可能導(dǎo)致表皮更新在長期的光-污染應(yīng)激（photo-pollution stress）下受損，還可能加重UVA1誘導(dǎo)的皮膚光損傷。該研究數(shù)據(jù)表明，空氣污染相關(guān)的皮膚異常可能是諸如BaP和IcdP這樣的“罪魁禍?zhǔn)住彼斐?，并能夠在極低濃度下增強(qiáng)UVA對皮膚的氧化應(yīng)激。

在無光照條件下，BaP和IcdP的細(xì)胞毒性和代謝效應(yīng)是有限的；而當(dāng)細(xì)胞同時暴露在UVA1和BaP或IcdP下，能顯著破壞細(xì)胞的氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)。研究還關(guān)注了皮膚細(xì)胞中線粒體的損傷情況。PAH+UVA1處理后細(xì)胞線粒體內(nèi)超氧化陰離子的增加也可能促進(jìn)細(xì)胞整體的氧化應(yīng)激（DHR-123探針可檢測到）。線粒體膜去極化可能是由線粒體的直接（或間接）靶向作用所導(dǎo)致，特別是IcdP的作用。此外，ATP合成減少也可能反應(yīng)了電子傳遞鏈的功能障礙，BaP主要在該作用上起效。無論機(jī)制如何，可以肯定的是光-污染應(yīng)激可以破壞皮膚細(xì)胞中能量的產(chǎn)生。

機(jī)體對光-污染應(yīng)激的保護(hù)之一是內(nèi)源性解毒機(jī)制的啟動，如應(yīng)激發(fā)生幾小時后細(xì)胞內(nèi)GSH減少。此外，作者還觀察到使用BSO破壞了GSH的生物合成后，細(xì)胞光毒性的增強(qiáng)。GSH是在胞質(zhì)溶膠中合成的，一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中。GSH的內(nèi)穩(wěn)態(tài)是保護(hù)線粒體所必需的，這樣才能幫助細(xì)胞抵御ROS和親電代謝物。該研究證實(shí)了在皮膚遭受光-污染應(yīng)激時，GSH所起的這種必要的保護(hù)作用。另外，PAH和UVA1協(xié)同作用可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞SLC7A11基因和蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，該結(jié)果表明，GSH的更新主要依賴于胱氨酸的供應(yīng)，而其他基礎(chǔ)酶的活性可能足以應(yīng)付該實(shí)驗(yàn)條件下所產(chǎn)生的應(yīng)激強(qiáng)度。UVA1和BaP或IcdP協(xié)同作用NHEK后5 h可觀察到SLC7A11基因表達(dá)的顯著誘導(dǎo)。當(dāng)使用低濃度的PAH時，SLC7A11的表達(dá)在處理后18 h減少至其初始水平。表明人體基礎(chǔ)解毒代謝能夠應(yīng)付輕微的光-污染應(yīng)激。另一方面，對高濃度、具有光毒性的PAH暴露，角質(zhì)形成細(xì)胞需要更長的時間（＞18 h）進(jìn)行恢復(fù)。角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)SLC7A11（mRNA和蛋白質(zhì)）表達(dá)量還是PAH±UVA1誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的有趣標(biāo)記物，可被視作表皮光-污染應(yīng)激的早期標(biāo)記物。

［孔佩慧編譯,摘自Soeur J,Belaidi JP,Chollet C,et al.Photopollution stress in skin:traces ofpollutants（PAH and particulate matter）impair redox homeostasis in keratinocytes exposed to UVA1［J］.J Dermatol Sci,2017,86（2）:162-169.DOI:10.1016/j.jdermsci.2017.01.007.］

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