Smad與骨質(zhì)疏松癥

陳偉健 謝煒星 溫龍飛 李鉞 任東成 晉大祥 丁金勇 龔水帝 郭惠智 陳嘵俊

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

OP是一種常見的全身性骨代謝疾病，以骨量減少和骨組織微細結(jié)構(gòu)破壞為特征，并進一步導(dǎo)致患者骨質(zhì)脆性增加和易于發(fā)生骨折。骨骼是一個動態(tài)的活性組織，它需要通過不斷的重塑來維持骨礦化平衡及骨結(jié)構(gòu)的完整，持續(xù)的骨重建是保護骨骼健康的重要前提，由OC介導(dǎo)不斷吸收骨基質(zhì)，隨后由OB負責(zé)替代新骨。在骨重塑的過程中骨形成和骨吸收保持一種動態(tài)平衡，稱為骨穩(wěn)態(tài)。OP就是由于這種骨穩(wěn)態(tài)被打破而導(dǎo)致的。OB和OC之間的相互調(diào)節(jié)，是保持骨形成和骨吸收之間骨穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。

Smad蛋白家族是近年通過基因篩查的辦法在無脊椎動物中鑒定出來的新的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白。TGF-β通路與BMP通路是調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的重要通路。隨著不斷深入研究 Smad 蛋白家族發(fā)現(xiàn)，Smad 主要參與TGF-β通路與BMP通路的信號傳導(dǎo)，對OB與OC的形成與分化發(fā)揮重要作用。

1 Smad蛋白的介紹

1.1 Smad蛋白家族的發(fā)現(xiàn)

人們最初通過對果蠅進行基因篩查的研究，發(fā)現(xiàn)了在TGF-β家族信號通道下游的 Mad 多肽有一個高度保守且未知的結(jié)構(gòu)域，而這一結(jié)構(gòu)域與從線蟲中分離的 3 種 cem-1、cem-2、cem-3 多肽相比較，具有高度的相似性， Mad 從此就作為了一個新的蛋白質(zhì)家族出現(xiàn)在人們面前。接著人們又通過基因篩查在新小桿線蟲上發(fā)現(xiàn) Sma-2、Sma-3、Sma-4 都有一個保守的結(jié)構(gòu)域，編碼屬于同一個蛋白家族，而且都處于 TGF-β 信號通道的下游，結(jié)構(gòu)與Mad蛋白相近，說明Sma蛋白與Mad蛋白聯(lián)系密切。后來進一步研究發(fā)現(xiàn)Mad蛋白和Sma蛋白都作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(分別稱為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體)下游，因此人們將 Mad蛋白 和 Sma 蛋白及其類似物統(tǒng)稱為 Smad 蛋白家族[1]。

1.2 Smad蛋白的分類

目前已經(jīng)有 9 種 Smad 成員相繼被報道，分別用Smad 1～ Smad 9表示。按照結(jié)構(gòu)和功能，Smad 可以被分為 3類: 第一類，受體調(diào)節(jié)的 Smads(R-Smads)，包括 Smad 1、2、3、5、8、9。Smad 2和Smad 3是TGF-β或活化素的特異性中介物，Smad 2和Smad 3因TGF-β和TGF-βⅡ型受體與激活素受體樣激酶類ALK4/5/7之間形成的復(fù)合物或活化素和活化素受體2發(fā)生磷酸化，負責(zé)參與TGF-β和活化素信號傳導(dǎo)途徑； BMPs I型受體ALK1/2/3/6、BMPs II型受體或活化素受體2形成的復(fù)合物則可激活Smad 1、5、 8，可能還有Smad 9，參與傳導(dǎo)BMP信號傳導(dǎo)。較早的研究已證實BMP-2/4就是通過Smad 1、5、8傳遞信號。第二類，共同介導(dǎo)的Smads(Co-Smad)，目前發(fā)現(xiàn)只有一種，就是 Smad 4。Smad 4就像一個中央傳感器，既不能被磷酸化，也不能結(jié)合TGF-β受體或BMP受體，但它幾乎能與所有激活的 R-Smads 形成異源的多聚復(fù)合物，并因此參與和調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因為Smad 4有一個富含脯氨酸的Smad 4活化區(qū)(Smad 4 activiation domain,SAD) 能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活和抑制因子的相互作用，這是激活 R-Smads 所依賴的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的。第三類，抑制性的 Smads(Ⅰ-Smads)，包括 Smad 6和Smad 7。在大多數(shù)靜息細胞中，Ⅰ-Smads 位于細胞核中，當(dāng)受到 TGF-β 刺激或泛素化調(diào)節(jié)因子Smurf1 過度表達時，Smad 6、7 從細胞核進入細胞質(zhì)，Ⅰ-Smads 與Ⅰ型受體結(jié)合，競爭性的干擾 R-Smads募集和磷酸化，并同時抑制R-Smads 和 Co-Smad 復(fù)合物的形成和活性。Smad 6、7 還可以與泛素化連接酶Smurf E3 相作用，使其結(jié)合到Ⅰ型受體，導(dǎo)致受體降解，終止信號傳導(dǎo)。Smad 7 也能直接在細胞核上發(fā)揮作用，抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。Ⅰ-Smads蛋白可以作為TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)自我調(diào)節(jié)的一種負反饋信號，因為TGF-β可以誘導(dǎo)Ⅰ-Smads的mRNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所以Ⅰ-Smads能起到負反饋的作用緊密地控制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ⅰ-Smads能抑制Smad蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Smad 6主要抑制BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Smad 7則能抑制TGF-β和BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-4]。

1.3 Smad蛋白的結(jié)構(gòu)特征

Smad蛋白的N區(qū)和 C區(qū)有一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別稱為MH1(Mad homology domain-1) 和 MH2(Mad homology domain-2),富含脯氨酸(Pro)。 MH1 和 MH2 之間是氨基酸序列與長度可變化的中間連接區(qū)(L)。MH2是功能效應(yīng)區(qū)，MH2 的功能包括與I 型受體發(fā)揮效應(yīng)，形成 Smad 多聚復(fù)合物，結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄共激活劑或共抑制劑。MH2在所有的 Smad 蛋白中是高度保守的。MH1是MH 2的功能抑制區(qū), 在未激活時，MH1抑制 MH2 的功能；當(dāng)激活后，MH1 負責(zé)結(jié)合到特異性的 DNA 序列。與MH2不同，MH1 只有在 R-Smad 和 Co-Smad中才是保守的。Smad蛋白的MH 1與MH2以結(jié)合狀態(tài)存在，當(dāng)受體與配體結(jié)合被活化后兩者解離，形成Smad復(fù)合體向核內(nèi)移行，在核內(nèi)蓄積引起靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前L區(qū)的功能尚不清楚[5]。

1.4 Smad通路作用機制

盡管Smad通路存在大多數(shù)的細胞類型和組織，但它是受TGF-β/BMP激活的額外通路。在TGF-β通路中，當(dāng)TGF-β 家族配體結(jié)合到Ⅱ型受體就激活Ⅱ型受體激酶，然后磷酸化Ⅰ型受體激酶上游富含甘氨酸 /絲氨酸的GS 區(qū)，GS 區(qū)的磷酸化又會激活Ⅰ型受體激酶，導(dǎo)致Ⅰ型受體發(fā)生自我磷酸化和細胞內(nèi)的 R-Smads一過性地與Ⅰ型受體直接進行配體結(jié)合形成復(fù)合物，R-Smads的 C 區(qū)的Ser-Ser-Val/Met-Ser 序列(SSXS 區(qū))發(fā)生磷酸化。磷酸化的 R-Smads與Ⅰ型受體分離并與 Smad4 形成復(fù)合物。在BMP通路中，BMP首先與二型受體(BMP RⅡ)結(jié)合使其磷酸化，然后活化的BMP RⅡ磷酸化一型受體(BMP R I)并與其結(jié)合形成復(fù)合物?；罨氖荏w復(fù)合物進一步激活一系列下游受體調(diào)節(jié)R-Smads，磷酸化的R-Smads與受體分離，與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物。通過TGF-β通路和BMP通路形成的這些復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細胞核與不同的 Smad結(jié)合原件(Smad-binding elements，SBE)、DNA 轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共激活劑或共抑制劑結(jié)合，并向核內(nèi)移行,在核內(nèi)蓄積引起正性或者負性調(diào)控調(diào)控靶基因的表達[6-8]。Ⅰ-Smads 的N區(qū)與其他通路的特異性有關(guān)并且缺乏MH1，能與R-Smad競爭TGF-β和BMPs的I型受體，從而抑制R-Smad的磷酸化，抑制Smad通路，具體見圖1[9]。

2 Smad與骨質(zhì)疏松癥

隨著全球人口老齡化的趨勢，OP在全球的發(fā)病率也逐年增高，嚴重威脅著老年人的健康。OP的發(fā)病機制主要是由OB介導(dǎo)的骨形成與OC介導(dǎo)的骨吸收之間的骨穩(wěn)態(tài)失衡。OC相對比OB活躍，即骨吸收的趨勢大于骨形成的趨勢。Smad主要通過TGF-β/BMP通路直接參與誘導(dǎo)OB與OC的生成、分化，在調(diào)節(jié)骨代謝方面扮演著不可或缺的角色。

2.1 Smad蛋白與成骨細胞

負責(zé)骨形成活動的OB是由骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)分化而來的，OB增殖分化由多種生長因子調(diào)控，包括TGF-β、BMP、Smad等。TGF-β與BMP通路都能促進骨形成，而兩者的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都由Smad直接介導(dǎo)。

2.1.1在BMP通路中Smad蛋白與成骨細胞

BMPs是誘導(dǎo)OB分化和骨形成的有效的親骨因子，在動物中已被證實能誘導(dǎo)骨形成。BMP-2通過增加OB分化的標(biāo)志酶-堿性磷酸酶ALP活化和骨鈣蛋白等基因的表達，誘導(dǎo)BMSCs向OB分化，促進骨形成。在所有Smad蛋白中，與成骨細胞分化關(guān)系密切的是 Smad 1和 Smad 5。Smad 1、5通過與BMP-Ⅰ A型或Ⅰ B型受體結(jié)合后直接活化、磷酸化， 接著 與2個或1個R-Smad 和 1 個Smad 4 以異源三聚體或異源二聚體的形式進入細胞核內(nèi)，作用于成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子 runx2、Osterix等基因序列并上調(diào)其表達[6-8]。另外，Smad 1或Smad 5能特異地與OB分化密切相關(guān)的PEBP 2αA/AML 3 /CBFA 1基因啟動子結(jié)合，一起誘導(dǎo)OB分化。在BMP-2缺乏的情況下，Smad 1或Smad 5過表達，也可以誘導(dǎo)ALP的活化和OB分化。特異性地敲除Smad1會引起骨量的減少。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，mi R-155在BMP-2刺激后表達下調(diào)，具有抑制成骨細胞分化為骨細胞的能力，其機理正是通過與Smad 5 mRNA的3’-UTR端結(jié)合抑制其基因表達[10]。Liu等[11]通過收集50位骨折的老年患者的骨樣本，發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，與年齡相關(guān)的PLEKHO1 mRNA水平上升會減少Smad 1/5 (p-Smad1/5)的磷酸化，抑制OB的生成。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號通路的配體DLL1 在體內(nèi)外都具有促進 BMP9 誘導(dǎo) BMSCs 成骨分化的作用，且該效應(yīng)可能通過影響 BMP9 信號通路的多個環(huán)節(jié)來實現(xiàn)。DLL1 能促進 BMP Ⅰ型受體 ALK2 的表達，同時也能上調(diào) Smad1 /5 /8 磷酸化水平及 SBE 的轉(zhuǎn)錄活性[12]。這些研究發(fā)現(xiàn)都說明了Smad蛋白是直接參與BMP通路誘導(dǎo)OB形成過程中的信號通路，OB的形成與磷酸化的Smad密切相關(guān)。

2.1.2在TGF-β通路中Smad蛋白與成骨細胞

除了BMP通路， Smad也能通過TGF-β通路促進OB形成。在該通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，TGF-β先結(jié)合其II型受體，再激活其I型受體，組成受體復(fù)合物，受體復(fù)合物攜帶信號進入細胞膜后，因 Smad 受體激活錨蛋白在細胞膜及早期內(nèi)涵體膜上已錨定 Smad2或Smad3 蛋白，激活的TGF-β識別并結(jié)合活化Smad 2或Smad 3 蛋白[13]。Smad 2或Smad 3活化后與Smad 4形成復(fù)合物異位入核，啟動細胞內(nèi)信號反應(yīng)的級聯(lián)傳導(dǎo)，通過MH1區(qū)的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)與DNA上的SBE直接結(jié)合，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，影響成骨細胞的增殖、分化及I型膠原蛋白的合成。有學(xué)者報道，葛根素促進骨形成正是通過刺激Smad 2/3 mRNA的表達和刺激TGF-β1的分泌和合成[14]。此外，TGF-β還可誘導(dǎo)OB自身表達并誘導(dǎo) BMP-2 在OB中的表達，增加其成骨能力。

2.2 Smad蛋白與破骨細胞

負責(zé)骨吸收活動的OC起源于造血干細胞， OC的形成依賴于核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B Ligand，RANKL)和集落刺激因子1(colony stimulating factor -1，CSF-1)的協(xié)同作用，兩者都源于OB的分泌。CSF-1在未成熟的OC表面結(jié)合其受體激活信號通路對于破骨細胞前體的增殖與存活必不可少；而RANKL對于OC的成熟、分化更是起核心作用，RANKL在破骨細胞前體細胞表面與RANK通過可溶性或膜結(jié)合，促使成熟OC的形成，激活和存活。

2.2.1在TGF-β通路中Smad蛋白與破骨細胞

至今為止，人們知道TGF-β對OC的生成有密切聯(lián)系， TGF-β可以直接作用于骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages，BMMs)并促進OC的形成， RANKL 與巨噬細胞集落刺激因子結(jié)合誘導(dǎo)OC生成，在這一過程中內(nèi)源性的TGF-β是關(guān)鍵。TGF-β能招募破骨細胞前體到骨環(huán)境中并在RANKL的幫助下推動OC分化，促進骨吸收。在破骨細胞分化過程中，TGF-β與其II型受體結(jié)合并招募和磷酸化I型受體，導(dǎo)致smad 2和Smad 3的磷酸化，負責(zé)TGF-β通路下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體而言，TGF-β增強了RANKL介導(dǎo)smad 2或Smad 3與Smad 4組成的復(fù)合體易位到細胞核并與Nfatc1靶基因結(jié)合，驅(qū)動Nfatc1的表達，這是調(diào)控OC分化的關(guān)鍵因素，在這過程中，腫瘤壞死因子受體連接因子6與 Smad 3的MH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合也起著關(guān)鍵的作用[15]。然而有趣的是，TGF-β又會影響B(tài)MMs周圍的基質(zhì)細胞而間接抑制OC的形成。其次，TGF-β能促進OB分泌骨保護素，通過結(jié)合RANK而影響RANK與RANKL的相互作用，進而抑制OC的活性和分化[16]。Yasui等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)阻擋Smad通路后，RANKL誘導(dǎo)OC形成受到抑制，此時激活的突變Smad 2或Smad 3能翻轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，Smad 2/3直接與TRAF6-TAB1-TAK1組成復(fù)合物，該復(fù)合物能刺激RANKL并對OC分化起關(guān)鍵作用。阻擋TGF-β信號通路，卻未發(fā)現(xiàn)TRAF6-TAB1-TAK1復(fù)合物。進一步分析發(fā)現(xiàn)Smad3的MH2區(qū)對于TRAF6-TAB1-TAK1 形成復(fù)合體是必要的。可見，TGF-β刺激激活Smad2或 Smad 3，Smad 2或 Smad3直接與TRAF6-TAB1-TAK1結(jié)合形成復(fù)合物，可促使RANKL誘導(dǎo)OC形成。

2.2.2在BMP通路中Smad蛋白與破骨細胞

在BMPs中，BMP-2與OC的形成有密切關(guān)系，并且BMP-2可刺激OC的骨吸收活動。BMP-2 主要可以誘導(dǎo)CSF-1的表達促進OC的形成，而專門介導(dǎo)BMP通路的Smad與CREB結(jié)合蛋白協(xié)同作用能增加CSF-1 的表達，CSF-1 的表達的上調(diào)能促進OC的生成。而與OC形成和分化密切相關(guān)的RANKL，BMP-2在白細胞介素-1α的作用下可增加其表達以此來促進OC的形成，并提高OC的存活率和促進OC的分化。然而BMP-2自身并不具備使OC的存活率提高的作用。Yoshikawa[18]等發(fā)現(xiàn)在敲除Smad1的初代OB中BMP-2所誘導(dǎo)RANKL mRNA的表達受到抑制，導(dǎo)致OC的形成減少。

除了負責(zé)介導(dǎo)TGF-β信號通路的Smad 2或 Smad 3和負責(zé)介導(dǎo)BMP通路的Smad 1和Smad 5被報道與OC的形成有關(guān)系外，Smad 4作為Co-Smad與因TGF-β/BMP刺激而磷酸化的R-Smads結(jié)合形成復(fù)合物參與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，也與OC的形成密切相關(guān)。Amy等[19]研究發(fā)現(xiàn)分別敲除Smad 1、4、5后，OC的骨吸收的活動減弱，OC分化的標(biāo)記物表達減少，由此可見Smad 1、4、5的表達對于OC的分化是必要的。另外，Li 等[20]用敲除Smad7基因外顯子1的小鼠模擬Smad7部分功能缺失，與正常小鼠對照，左股骨干骺端的形態(tài)和長度沒有明顯差別，但骨量與骨小梁比對照組減少，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)OC比對照組多。由此說明，Smad7部分功能缺失會抑制骨形成，促進骨吸收。由此看出，Smad7似乎也與OC的形成有某種密切的關(guān)系。

3 Smad在骨質(zhì)疏松研究中的前景

綜上所述， OP的發(fā)病機制主要是由OB介導(dǎo)的骨形成與OC介導(dǎo)的骨吸收之間的骨穩(wěn)態(tài)失衡。而Smad在不同因素下通過TGF-β/BMP通路直接參與誘導(dǎo)OB與OC的生成、分化，在調(diào)節(jié)骨代謝方面作用顯著。然而目前對Smad的研究仍處于初級階段，對骨形成與骨吸收的研究主要還只是局限在動物研究方面，較少直接對骨質(zhì)疏松患者進行研究探討，對其精確的調(diào)節(jié)機制也未完全清楚，在TGF-β/BMP通路下參與調(diào)節(jié)的Smad都有促進OB和OC形成的作用，究竟在其中哪些因素能誘導(dǎo)Smad促進OB形成，哪些因素能誘導(dǎo)Smad促進OC形成，現(xiàn)在也未完全清楚。今后仍需通過相關(guān)研究，探究Smad在骨形成和骨吸收方面發(fā)揮作用的具體機理和影響因素，如何促進OB的形成而又避免促進OC的形成，更是今后防治骨質(zhì)疏松癥的藥物研究的一個熱點。