千層塔繁殖技術(shù)研究進展

王曉澗

（延安大學生命科學學院，陜西延安716000）

千層塔繁殖技術(shù)研究進展

王曉澗

（延安大學生命科學學院，陜西延安716000）

千層塔是藥食兼用植物，營養(yǎng)及藥用價值很高，其中分離出的石杉堿甲具有強生物活性，是一種高效可逆的乙酰膽酯酶抑制劑，對于老年癡呆癥療效顯著，市場需求量很大。但是全草中的石杉堿甲含量低，千層塔又生長緩慢，資源瀕于枯竭。為了保護和充分利用千層塔，本文綜述了千層塔的扦插繁殖、芽胞繁殖、組織培養(yǎng)技術(shù)等方面的最新研究成果，為千層塔資源保護、人工繁殖提供參考。

千層塔；石杉堿甲；扦插；芽胞；組培

千層塔（Huperzia serrata），為石杉科石杉屬多年生草本植物蛇足石杉的全草[1]，又名金不換、虱子草、寶塔花等。千層塔具有清熱解毒、生肌止血、散瘀消腫等功效，民間多用于治跌打損傷、瘀血腫痛、內(nèi)傷出血，還用于治癰癤腫毒、毒蛇咬傷、燒燙傷等，少量鮮食可防治老年癡呆癥。千層塔的有效成分主要有生物堿、三萜類化合物和黃酮類化合物等。1972年我國科技工作者首先報道了從該植物中分離的石杉堿甲具有藥理作用，治療老年癡呆癥療效顯著。目前石杉堿甲在美國已經(jīng)進入三期臨床研究，在我國也已獲批上市并進入四期臨床。由于所含石杉堿甲具有的顯著藥理作用帶來了巨大的市場效益，千層塔天然提取物在世界市場上的交易價格高達50萬美元/kg，被譽為“植物的黃金”。

在巨大的經(jīng)濟利益驅(qū)使下，野生千層塔被人為大量采掘和破壞，致使該資源處于瀕臨滅絕的狀態(tài)。千層塔生長緩慢，而且野生千層塔以孢子繁殖為主，孢子萌發(fā)周期長，地下生配子體需6～15年才能成熟[2]。近20多年來，石杉堿甲的合成研究一直是有機合成化學家和藥物學家的熱點課題，綜觀目前為止所報道的各種合成方法，均具有一定的局限性，很難以較低成本大量合成高光學活性的石杉堿甲[3]。從植物中提取石杉堿甲，依然是目前最有效的方法，但從植物中提取石杉堿甲由于原料有限，遠遠滿足不了市場需求，因此，研究千層塔的人工繁殖技術(shù)，對豐富石杉堿甲的原料來源有重要意義。本文對千層塔的扦插繁殖、芽胞繁殖、組培繁殖等研究進行整理歸納，為千層塔人工繁殖及其有效成分可持續(xù)利用提供參考。

1 扦插繁殖技術(shù)

扦插繁殖是利用植物再生能力，取植株營養(yǎng)器官的一部分插入合適的基質(zhì)中，使之生根抽枝，成長為新植株的一種快速繁殖方法。扦插繁殖具有能夠繼承植物原有遺傳特性的優(yōu)點。千層塔枝條扦插能長出新根而成苗，且天然環(huán)境繁殖結(jié)果優(yōu)于人工環(huán)境[4]。

適當?shù)募に嘏c劑量能誘導千層塔生根并促進生長。馮世鑫等[5]研究發(fā)現(xiàn)蕓苔素內(nèi)酯對千層塔插穗生根與成活有促進作用，濃度2mg/kg時作用最強，成活率最高。盛束軍等[6]發(fā)現(xiàn)采用2000mg/L吲哚丁酸、1000mg/L生根粉處理，千層塔發(fā)根時間早，發(fā)根率和分叉率高，有利于插條的生長發(fā)育，扦插效果好。龍華等[7]發(fā)現(xiàn)在原生境中，插條在20mg/L萘乙酸中浸泡5min有助于千層塔生根，且效果顯著。

扦插育苗，要選擇適應植物生理的基質(zhì)。優(yōu)良的生長基質(zhì)要求基質(zhì)多孔、通氣、排水良好和能保持濕潤[8]，腐殖土與河沙的混合土壤作扦插基質(zhì)比兩者單獨作為基質(zhì)效果要好[6]。千層塔生長繁殖與內(nèi)生真菌存在一定的共生關(guān)系，原生境土壤含有的多種微生物、內(nèi)生真菌和根表真菌提高了千層塔生根過程中吲哚-3-乙酸和兒茶酚、綠原酸、阿魏酸等酚類化合物含量，使得原生境土壤上千層塔扦插生根率提高[9]。土壤pH值對千層塔的生長發(fā)育影響很大，在弱酸性土壤中扦插苗能夠正常地生長發(fā)育和繁殖，但在堿性土壤中多數(shù)植株會死亡。

2 芽孢繁殖

石杉屬植物是一類古老的小型擬蕨類植物，在自然條件下，千層塔的繁殖主要是孢子繁殖、分株繁殖和芽胞繁殖。芽胞是一種變態(tài)葉，千層塔芽胞有5個胞片和1個幼芽構(gòu)成。胞片起保護作用，幼芽萌發(fā)長出葉與莖，芽胞基部生根。芽胞也是一種重要的營養(yǎng)繁殖體，與孢子繁殖相對比，數(shù)量遠不及孢子數(shù)量，但萌發(fā)速度快，生成的新植株生長快，培養(yǎng)容易。因此，芽孢繁殖是一種快繁方式[10]。

千層塔通常于每年春季在植株分枝的頂部圍繞莖產(chǎn)生芽胞，秋季逐步從母株脫離。芽胞產(chǎn)生的時間和數(shù)量因生境和植株株齡的差異而有較大的差異。芽胞自母株脫離后在合適的土壤基質(zhì)中能迅速生長成新植株，其萌發(fā)途徑有：（1）芽胞在母株芽托上已萌發(fā)，長出莖葉，受外力作用后脫離母株，接觸基質(zhì)后萌生新根，長成新植株；（2）芽胞在母株芽托上未萌發(fā)，脫離接觸基質(zhì)后發(fā)育，同時形成根和幼葉[10]。

光照和濕度是芽胞萌發(fā)的關(guān)鍵因素[7]。在光照充足、相對濕度達85%以上的生境中，脫落在土壤表層的芽胞經(jīng)光刺激約15d后開始萌發(fā)。土壤表層下的芽胞隨著埋藏深度的增加，萌發(fā)率降低。未萌發(fā)的芽胞并未死亡而是進入休眠狀態(tài)，土壤下眾多的休眠芽胞形成了“芽胞庫”。休眠的芽胞再次移至土壤表層，很快就能萌發(fā)。這種“芽胞庫”對于維持千層塔種群的穩(wěn)定以及抗逆性都有重要意義。

在人工培養(yǎng)條件下培養(yǎng)芽胞，Moore培養(yǎng)基中芽胞萌發(fā)時間短，生長情況好。培養(yǎng)溫度對千層塔芽胞的萌發(fā)起著重要作用，芽胞萌發(fā)的最適宜溫度為22℃，但對后期生長發(fā)育無顯著影響。芽胞的萌發(fā)與生長也適宜在弱光下培養(yǎng)，強光能抑制不定根的生長。赤霉素對芽胞萌發(fā)及生長有抑制作用[11]。

3 組織培養(yǎng)技術(shù)

組織培養(yǎng)是在無菌條件下，用培養(yǎng)基給外植體提供營養(yǎng)與激素，使其再生植株或者獲得其他有經(jīng)濟價值的產(chǎn)品的技術(shù)，也是一種快速繁殖技術(shù)。千層塔自然繁殖能力低，可以采用組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)快速繁殖。

3.1 外植體消毒

組織培養(yǎng)必須要在嚴格無菌的條件下進行，培養(yǎng)基若染菌，微生物快速繁殖，與外植體爭奪營養(yǎng)，分泌物抑制外植體生長。千層塔植物體內(nèi)存在數(shù)量眾多的內(nèi)生真菌，而外植體壁薄，消毒困難，滅菌成功率低，如何有效消毒是千層塔組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

孢子囊、孢子、莖尖等材料幾乎不含內(nèi)生菌，只需要表面消毒處理即可。楊雪飛等[12]用孢子體為材料，用70%乙醇滅菌40s、0.1%升汞溶液滅菌8min、70%雙氧水溶液滅菌10min，進行表面滅菌，培養(yǎng)2周，表面無菌率達63%。李貴等[13]用孢子囊和莖尖為材料，經(jīng)預處理后，再經(jīng)過70%酒精處理30s、0.1%升汞處理4min，培養(yǎng)2周，污染率極低。

莖段、頂芽等材料含內(nèi)生菌的材料需要內(nèi)消毒和表面消毒相結(jié)合才能取得好效果。李貴等[13]以莖段為材料，經(jīng)預處理后，用47℃熱水預處理1h，再用70%酒精處理30s、0.1%升汞處理7min，能達到較好的表面消毒及內(nèi)生菌消除的效果。馬英姿等[14]以頂芽做材料，采用0.5mg/L孔雀石綠及100mg/L的混合抗生素（每100mgAAS溶液中包含30mg青霉素、50mg鏈霉素和125μg兩性霉素）混入1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d，再轉(zhuǎn)入1/2MS初代培養(yǎng)基中進行初代培養(yǎng)，獲得較好的外植體內(nèi)生菌殺滅效果。

3.2 外植體培養(yǎng)

用頂芽消毒殺菌得到無菌苗，無菌苗用1/2MS＋25g/L蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)90d后，外植體頂芽形成新二叉分枝。在二叉分枝后的新枝長到4～5cm時剪下進行繼代培養(yǎng)，得到叢生芽[15]。頂芽的誘導形成受培養(yǎng)基中蔗糖濃度的影響，當蔗糖濃度為1%時，芽全部白化死亡；提高蔗糖濃度，芽伸長生長，并在基部產(chǎn)生叢生不定芽；蔗糖濃度為2%時，所有轉(zhuǎn)接的新芽均發(fā)生叢生不定芽；當蔗糖濃度為2%～4%時，轉(zhuǎn)接的新芽在頂端和基部均出現(xiàn)GGB（綠色球狀體）[16,18]，GGB的發(fā)生率隨蔗糖濃度提高而提高，低濃度時以頂端GGB為主，高濃度時以基部GGB為主[19]。GGB分離培養(yǎng)，增殖分化成叢生苗，每叢平均有16個叢生芽，繁殖系數(shù)高。不定芽長長后，切下繼代培養(yǎng)，千層塔數(shù)量就得到擴增。

組織培養(yǎng)中經(jīng)常誘導外植體脫分化，形成愈傷組織，愈傷組織誘導再分化，形成不定芽、不定根進而形成完整植株，實現(xiàn)數(shù)量擴增。周穎[17]等把莖尖在MS+0.05μmol/L IBA+1.4μmol/LKT+2mg/L谷氨酰的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3個月后，誘導出了愈傷組織，誘導率為12.5%。目前還沒有再分化的報道。

3.3 外植體生根

千層塔的頂芽、側(cè)芽和不定芽，必須誘導生根后才能下地栽培，形成完整的組織培養(yǎng)快繁體系。馬英姿[14]等用千層塔的頂芽與側(cè)芽接種在添加IBA1.0mg/L+谷氨酰胺2.0mg/L的1/3MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，側(cè)芽的生根率可達90%，頂芽的生根率也可達30%。新枝外植體可以用不含激素的培養(yǎng)基（1/4MS礦質(zhì)元素+1/2MS有機元素+2%蔗糖+4.5g/L瓊脂，pH5.8）培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6月后，有42%外植體從莖下端切口處自然生根[12]。

4 展望

在人工合成取得有效突破之前，通過千層塔提取天然石杉堿甲依然是解決藥源的主要途徑，市場需求量巨大。人工繁殖研究雖然取得了一定的成就，但是距離大規(guī)模商業(yè)化種植還有許多工作要做。未來可以從以下幾個途徑入手：（1）選育良種，使用雜交育種、無性系選擇育種、誘變育種和分子育種等多種育種手段運用[20]，選育生長速度更快、石杉堿甲含量更高的千層塔優(yōu)良品種，進而為石杉堿甲提取提供原料；（2）建立千層塔組培快繁系統(tǒng)，組培技術(shù)越來越多的應用于中草藥生產(chǎn)，其具有生長快、周期短、繁殖系數(shù)高，可周年生產(chǎn)等優(yōu)點；建立千層塔組培快繁系統(tǒng)不僅有利于千層塔無性快繁，還將對于千層塔的種質(zhì)資源保存、新品種開發(fā)等具有積極意義。

[1]丁景和.藥用植物學[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1991.

[2]中山大學生物系,南京大學生物系.植物學[M].北京:人民教育出版社,1978.

[3]鄭書巖,郁春輝,沈征武.石杉堿甲的合成研究進展 [J].有機化學,2013,33(11):2261-2270.

[4]曾漢元,張伍佰.藥用植物蛇足石杉的營養(yǎng)繁殖[J].懷化學院學報:自然科學,2008,27(8):49-51.

[5]馮世鑫,馬小軍,閆志剛,等.蕓苔素內(nèi)酯對蛇足石杉插穗生根成活的影響[J].中國種業(yè),2010,(s1):64-66.

[6]盛束軍,徐建中,王志安,等.千層塔扦插繁殖研究[J].資源開發(fā)與市場,2000,16(5):268-269.

[7]龍華,李菁,李鸝,等.蛇足石杉扦插及芽胞繁殖研究[J].中藥材,2014,37(7):1115-1121.

[8]哈特·曼凱斯特,鄭開文,吳應祥,等.植物繁殖原理和技術(shù)[M].北京:中國林業(yè)出版社,1985.

[9]李娜,陳鈞,朱大元.土壤微生物影響蛇足石杉扦插生根的機制研究[J].中國中藥雜志,2007,32(23):2478-2481.

[10]王德立,馮錦東.蛇足石杉的芽胞特性和芽胞繁育技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,(2):805-807.

[11]駱冰潔,姚茂君,曹德華.蛇足石杉芽胞萌發(fā)及生長發(fā)育的影響因素 [J].吉首大學學報（自然科學版）,2016,37(1): 64-68.

[12]楊雪飛,羅建平,王瑛.蛇足石杉莖尖滅菌方法與組織培養(yǎng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(12):4947-4948.

[13]李貴,李菁,黎有有,等.蛇足石杉外植體表面消毒及內(nèi)生菌消除方法[J].吉首大學學報（自科版）,2009,30(4):100-103.

[14]馬英姿,劉江海,許歡,等.蛇足石杉的離體培養(yǎng)[J].植物生理學報,2015,(4):465-470.

[15]劉江海,馬英姿,張家玲,等.蛇足石杉側(cè)芽的發(fā)生與培養(yǎng)研究[J].中草藥,2016,47(17):3103-3108.

[16]韓德偉,關(guān)麗霞,王振龍.鐵線蕨孢子組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(29):16162．

[17]張光飛,蘇文華.狹翅巢蕨的組織培養(yǎng)[J].植物生理學通訊, 2002,38(2):144.

[18]張光飛,蘇文華.水鱉蕨幼葉的離體快速繁殖 [J].云南大學學報,2002,24(3):234-236.

[19]李曉君,楊雪飛,朱皖南,等.蛇足石杉莖尖組織培養(yǎng)研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2014,16(5):387-390.

[20]石雷.觀賞蕨類GGP建立及育種研究[C].2013年中國蕨類植物研討會論文集.2013,11.

Research Progress on Propagation Technology ofHuperzia serrata (Thunb.)Trev

WANG Xiao-jian
(College of Life Science,Yan'an University,Yan'an 716000,China)

Huperzia serratais a kind of edible and medicinal plant with high nutritional and medicinal value.Huperzine A, extracted fromHuperzia serrata,has strong biological activity.Further study found that huperzine A is a good reversible inhibitor of acetylcholinesterase.Huperzine A is effective in the treatment of Alzheimer's disease,and the market demand is very large.Because the whole herb contains very little huperzine A andHuperzia serratagrowth is very slowly,soHuperzia serratatend to dry up.In order to protect and make full use ofHuperzia serrata,this review summarized the latest research results of cuttage propagation,spore propagation and tissue culture ofHuperzia serrata,and prospected the future research.

Huperzia serrata;huperzine A;cuttage;spore;tissue culture

S567

A

1008-1038(2017)08-0044-03

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.08.014

2017-02-17

延安大學校級科研項目（YDK2007-34）

王曉澗（1977—），男，講師，主要從事食品加工等方面的研究工作