HPLC與HPCE結(jié)合測(cè)定復(fù)方濕生扁蕾膠囊中6種化學(xué)成分含量

盧年華 趙慧巧 景明 劉娟娟 陳正君 陳暉

摘要：目的 建立HPLC與HPCE結(jié)合測(cè)定復(fù)方濕生扁蕾膠囊中木犀草素、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷及槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿含量的方法。方法 采用HPLC測(cè)定木犀草素、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷的含量，采用HPCE測(cè)定槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿的含量。結(jié)果 在確定的色譜條件下，復(fù)方濕生扁蕾膠囊中木犀草素、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷及槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿均被很好地分離。結(jié)論 本試驗(yàn)建立的HPLC與HPCE聯(lián)合測(cè)定法準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方濕生扁蕾膠囊中木犀草素、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：濕生扁蕾；苦豆子；含量測(cè)定；高效液相色譜法；高效毛細(xì)管電泳法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.021

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）12-0086-05

Content Determination of 6 Chemical Constituents in Compound Shisheng Bianlei Capsules by HPLC and HPCE LU Nian-hua， ZHAO Hui-qiao， JING Ming， LIU Juan-juan， CHEN Zheng-jun， CHEN Hui （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To establish the method of HPLC and HPCE to determine the contents of luteolin， swertisin， swertianolin， sophordine， matrine and oxymatrine in compound Shisheng Bianlei Capsules. Methods HPLC was used to determine the contents of luteolin， swertisin， and swertianolin. HPCE was used to determine the contents of sophordine， matrine and oxymatrine. Results Under a certain chromatographic conditions， luteolin， swertisin， swertianolin， sophordinei， matrine and oxymatrine in the compound Shisheng Bianlei Capsules were well separated. Conclusion The establishment of HPLC and HPCE combined determination method is accurate and reliable， and can be used to content determination of luteolin， swertisin， swertianolin， sophordine， matrine and oxymatrine in compound Shisheng Bianlei Capsules.

Key words： Gentianopsis paludosa； Sophora alopecuroides； content determination； HPLC； HPCE

復(fù)方濕生扁蕾膠囊是由甘肅省名中醫(yī)張銀川主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成的結(jié)腸靶向釋藥的口服固體制劑，由濕生扁蕾和苦豆子2味藥組成，具有清熱解毒、利濕止瀉功效，主治大腸濕熱所致的痢疾、腸炎等腸道疾病。在臨床應(yīng)用中，復(fù)方濕生扁蕾膠囊對(duì)慢性潰瘍性結(jié)腸炎具有確切的療效[1]。濕生扁蕾Gentianopsis paludosa（Munro）Ma.主要含有酮類、黃酮類和三萜類化合物，酮類和黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌等作用[2-4]。當(dāng)藥黃素是黃酮苷類化合物，對(duì)鼠傷寒桿菌具有中度抑制作用。當(dāng)藥醇苷為酮苷類化合物，具有抑制結(jié)核菌的作用[5]。木犀草素

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81360522、81560717）

通訊作者：景明，E-mail：1339512509@qq.com

是黃酮類化合物，對(duì)番瀉葉誘導(dǎo)的小鼠腹瀉模型具有較好止瀉作用[6]。苦豆子Sophora alopecuroides L.中富含生物堿、黃酮、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸及無(wú)機(jī)元素等多種成分[7]。藥理研究表明，苦豆子生物堿具有抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、升高白細(xì)胞、抗癌等作用，對(duì)各種細(xì)菌、真菌及病毒都有較強(qiáng)的殺滅作用[8-11]。目前該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)濕生扁蕾所含木犀草素的含量進(jìn)行測(cè)定，而苦豆子所含槐定堿等生物堿成分沒(méi)有相應(yīng)的含量測(cè)定方法，藥品的內(nèi)在質(zhì)量不能得到有效控制。本試驗(yàn)以方中濕生扁蕾所含當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素及苦豆子所含槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿為指標(biāo)成分，分別建立基于高效液相色譜法（HPLC）和高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）的定量測(cè)定方法，用以控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters600高效液相色譜儀和Waters2487 PDA檢測(cè)器（Waters公司），AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），Beckman PACE/MDQ高效毛細(xì)管電泳儀和DAD檢測(cè)器（Beckman公司），KQ-250B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

復(fù)方濕生扁蕾膠囊（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心自制，規(guī)格0.3 g/粒，批號(hào)20140901、20141002、20141103）；對(duì)照品木犀草素（批號(hào)111520-200504，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用）、當(dāng)藥黃素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)140525，HPLC純度>98%）、當(dāng)藥醇苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)140521，HPLC純度>98%）、槐定堿（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，批號(hào)110784，供含量測(cè)定用）、苦參堿（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，批號(hào)110805，供含量測(cè)定用）、氧化苦參堿（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，批號(hào)110780，供含量測(cè)定用）；甲醇和乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HPLC條件：色譜柱Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為甲醇（A）和0.04%磷酸水溶液（B），0～20 min為甲醇∶水=40∶60～63∶37線性梯度洗脫，20～50 min為甲醇∶水=63∶37等度洗脫；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 ?L。

HPCE條件：毛細(xì)管柱68.5 cm×75 ?m；緩沖液50 mmol/L磷酸氫二鈉，pH 5.5；電壓25 kV；溫度25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；壓力進(jìn)樣0.5 psi，3 s；每次運(yùn)行前，毛細(xì)管用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗2 min、水沖洗2 min、運(yùn)行緩沖液沖洗2 min；進(jìn)樣量10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素對(duì)照品21.28、23.54、46.44 mg，置于100 mL量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密吸取當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素貯備液各5 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的混合對(duì)照品溶液（含當(dāng)藥黃素4.256 ?g/mL、當(dāng)藥醇苷4.708 ?g/mL、木犀草素9.288 ?g/mL）。精密稱取槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品33.72、19.54、11.61 mg，置于100 mL量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密吸取槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿貯備液各5 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿的混合對(duì)照品溶液（含槐定堿6.744 ?g/mL、苦參堿3.908 ?g/mL、氧化苦參堿2.322 ?g/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方濕生扁蕾膠囊內(nèi)容物0.5 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇10 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 ?m濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為HPLC測(cè)定供試品溶液。精密稱取復(fù)方濕生扁蕾膠囊內(nèi)容物1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)65%乙醇60 mL，加入鹽酸使提取溶劑pH=0.5，超聲提取30 min（功率500 W，頻率40 kHz），將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇浸膏，加40 mL水將浸膏完全溶解，加NaOH溶液使浸膏水溶液pH=10.5。將溶液置于120 mL分液漏斗，加入40 mL氯仿震蕩，靜置。萃取3次，合并氯仿溶液，減壓濃縮至浸膏，用甲醇溶液溶解，定容于10 mL量瓶，搖勻，0.45 ?m濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為HPCE測(cè)定供試品溶液。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)貯備液制備 精密稱取氨茶堿對(duì)照品25.26 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得內(nèi)標(biāo)貯備液（含氨茶堿1.01 mg/mL）。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺濕生扁蕾陰性樣品0.5 g，按照HPLC測(cè)定供試品溶液的制備方法制備缺濕生扁蕾的陰性對(duì)照溶液。取缺苦豆子陰性樣品1.0 g，按照HPCE測(cè)定供試品溶液的制備方法制備缺苦豆子的陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 ?L，注入液相色譜儀，按色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果在與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致的位置上，樣品溶液的當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素峰形良好，理論板數(shù)按木犀草素計(jì)算不低于3000，當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素與相鄰峰的分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

精密吸取“2.2”項(xiàng)下槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿的混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)貯備液各2 mL，混勻，作為對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的混合液；吸取供試品溶液及內(nèi)標(biāo)貯備液各2 mL，混勻，作為供試品和內(nèi)標(biāo)的混合液；吸取陰性對(duì)照溶液及內(nèi)標(biāo)貯備液各2 mL，混勻，作為陰性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)的混合液。分別精密吸取上述3種混合液各10 ?L，注入毛細(xì)管電泳儀，按色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果在與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致的位置上，供試品溶液的槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿峰形良好，理論板數(shù)按槐定堿計(jì)算不低于3000，槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿與相鄰峰的分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

A

B

C

注：A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；

1.當(dāng)藥黃素；2.當(dāng)藥醇苷；3.木犀草素

圖1 復(fù)方濕生扁蕾膠囊中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素HPLC圖

A

B

C

注：A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；

1.槐定堿；2.苦參堿；3.氧化苦參堿；4.氨茶堿

圖2 復(fù)方濕生扁蕾膠囊中槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿、氨茶堿HPCE圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素對(duì)照品貯備液各1 mL，分別置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取2、6、10、15、20 ?L，注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰。精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品貯備液各1 mL，分別置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取2、4、6、8、10 ?L，注入高效電泳儀測(cè)定。分別以峰面積值對(duì)質(zhì)量（ng）進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

按“2.2.1”項(xiàng)下操作，精密吸取當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素混合對(duì)照品溶液20 ?L，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得當(dāng)藥黃素峰面積RSD=0.82%、當(dāng)藥醇苷峰面積RSD=0.80%、木犀草素峰面積RSD=0.73%。結(jié)果表明精密度良好。

按“2.2.1”項(xiàng)下操作，精密吸取槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿混合對(duì)照品溶液10 ?L，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得槐定堿峰面積RSD=0.93%、苦參堿峰面積RSD=0.87%、氧化苦參堿峰面積RSD=0.98%。結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)20140901），精密稱取內(nèi)容物6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在高效液相色譜儀進(jìn)樣20 ?L，記錄峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果當(dāng)藥黃素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.2 ?g/g，RSD=1.33%；當(dāng)藥醇苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.3 ?g/g，RSD=2.01%；木犀草素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.1 ?g/g，RSD=1.67%。表明重復(fù)性良好。

取同一批樣品（批號(hào)20140901），精密稱取內(nèi)容物6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在高效電泳儀進(jìn)樣10 ?L，記錄峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果槐定堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.8 ?g/g，RSD=1.42%；苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.8 ?g/g，RSD=1.97%；氧化苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.2 ?g/g，RSD=1.83%。表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h在高效液相色譜儀進(jìn)樣20 ?L，記錄色譜圖中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的峰面積，計(jì)算其RSD分別為0.49%、0.51%、0.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。

取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h在高效電泳儀進(jìn)樣10 ?L，記錄色譜圖中槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿的峰面積，計(jì)算其RSD分別為0.53%、0.66%、0.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素量的樣品（批號(hào)20140901）約0.25 g，共5份，分別加入當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為97.81%、97.51%、98.22%，見(jiàn)表3。

精密稱取已測(cè)定苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿量的樣品（批號(hào)20140901）約0.5 g，共5份，分別加入苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并注入高效電泳儀進(jìn)行測(cè)定分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為96.74%、96.67%、95.87%，見(jiàn)表4。

2.9 樣品測(cè)定

取3批次樣品，按上述制備和測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，每份平行測(cè)定3次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

3 討論

本研究采用HPLC測(cè)定復(fù)方濕生扁蕾膠囊中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的含量，同時(shí)采用HPCE測(cè)定復(fù)方濕生扁蕾膠囊中槐定堿、苦參堿和氧化苦參堿的含量。趙氏等[12]采用HPLC對(duì)濕生扁蕾與苦豆子配伍提取物中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的測(cè)定方法進(jìn)行了考察，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相及洗脫方式進(jìn)行了優(yōu)選，為復(fù)方濕生扁蕾膠囊質(zhì)量控制提供了可行的方法。有關(guān)苦豆子中生物堿的含量測(cè)定方法，已報(bào)道的主要有紫外吸收法（UC）、薄層色譜法（TLC）、HPLC、HPCE等方法。UC適宜測(cè)定總生物堿，且對(duì)樣品的純度要求較高；TLC雖然簡(jiǎn)便，但重現(xiàn)性差，影響因素多；采用HPLC分析時(shí)，由于苦豆子中生物堿成分的堿性強(qiáng)、極性大，色譜柱吸附太強(qiáng)，色譜峰拖尾嚴(yán)重，另外200 nm左右的近紫外吸收也造成雜質(zhì)成分太多而難以分離；而采用HPCE分析，不但分離效率高，還可有效消除溶劑及雜質(zhì)的干擾，峰形對(duì)稱尖銳。

本研究結(jié)果表明，采用HPLC測(cè)定復(fù)方濕生扁蕾膠囊中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素，同時(shí)采用HPCE測(cè)定復(fù)方濕生扁蕾膠囊中苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能夠?yàn)樵撝苿┑馁|(zhì)量控制提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015-12-10）

（修回日期：2015-12-22；編輯：陳靜）