固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中吡咯素的研究

劉慧琳,穆 琳,陳曉默,王 靜

(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué),北京 100048)

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固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中吡咯素的研究

劉慧琳,穆 琳,陳曉默,王 靜*

(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué),北京 100048)

采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)檢測食品中的吡咯素。食品原料采用OasisTMHLB固相萃取柱進行預(yù)富集,并用HPLC法進行檢測。結(jié)果表明,吡咯素在5×10-7～2×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999,RSD為0.78%～7.51%,最低檢出限為5×10-7mol/L(S/N=3)。本方法操作簡單,靈敏度高,可應(yīng)用于食品中痕量吡咯素的檢測。

高效液相色譜,固相萃取,吡咯素,檢測

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)是指蛋白質(zhì)中賴氨酸的氨基部分與還原糖的羰基部分在非酶條件下發(fā)生美拉德反應(yīng),生成穩(wěn)定的美拉德產(chǎn)物[1],主要包括吠喃糠酰咪唑(FFI)、羧甲基賴氨酸(CML)、吡咯素(Pyrraline)、戊糖素等[2]。研究發(fā)現(xiàn),人體每日攝入AGEs約25～75 mg[3],其中大部分是羧甲基賴氨酸(CML)和吡咯素(Pyrraline),它們被人體消化、吸收,并參與體內(nèi)的循環(huán)代謝,使慢性病的患病風(fēng)險大大提高,危害性很大。由免疫學(xué)檢測可知,糖尿病患者血清中的吡咯素含量顯著高于正常組,動脈粥樣硬化患者的腎小球基底膜以及胞外基質(zhì)均出現(xiàn)了不同程度的吡咯素積聚的現(xiàn)象[4],進而發(fā)展為腎小球硬化,最終引發(fā)腎衰竭。吡咯素作為定量檢測晚期糖基化終產(chǎn)物的重要指標(biāo)及衡量美拉德反應(yīng)程度的重要參數(shù)之一[5],不僅在控制食品加工工藝和保障食品安全方面發(fā)揮重要作用[6],對糖尿病腎病、糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病心血管病變、白內(nèi)障等疾病的診斷和研究具有重要的臨床意義[7]。

目前,吡咯素的檢測方法主要有反相高效液相色譜法[8-10]、光電二極管陣列檢測法等[11-12]。因食品基質(zhì)較為復(fù)雜,若直接利用反向高效液相色譜檢測會縮短色譜柱的使用壽命;而離子交換色譜雖然耐酸堿,應(yīng)用范圍較廣,易于再生、使用壽命長,但由于其機械強度較差、易溶脹且易被有機物污染,因此需要對實際樣品的預(yù)處理方法進行改進。固相萃取技術(shù)作為預(yù)處理方法,不僅起到了預(yù)富集和除雜的作用,還有效地簡化了檢測步驟并縮短了檢測時間,設(shè)備簡單,價格不高,分離速度可控,而且操作方便。此外,固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)具有分辨率高,重復(fù)性好等優(yōu)勢。

本文利用固相萃取技術(shù)作為預(yù)處理方法,結(jié)合高效液相色譜技術(shù)對實際樣品中的吡咯素進行了分析研究。通過優(yōu)化固相萃取柱的種類、洗脫液的組成、液相色譜檢測的流速以及樣品的酸水解條件,從而對牛奶、奶粉、咖啡、醬油等常見食品中的吡咯素進行準(zhǔn)確的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡咯素標(biāo)準(zhǔn)品(Pyrraline,純度為99.04%) 多倫多研究化學(xué)品公司;硼氫化鈉、硼酸鈉緩沖液、三氯乙酸、丙酮、鹽酸、乙酸、甲醇、氨水、三氟乙酸 均為分析純；乙腈 色譜純；高純水 ≥18 MΩ·cm-1;高鈣牛奶、純牛奶、全脂奶粉1、全脂奶粉2、絲滑拿鐵咖啡、原味咖啡、生抽醬油、老抽醬油 購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

島津LC-20A HPLC儀、Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱 島津(中國)有限公司;高速冷凍離心機 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;OasisTMHLB固相萃取柱(3 cc,60 mg) 沃特世科技(上海)有限公司;MCX固相萃取柱(60 mg,3 mL)、C18固相萃取柱(60 mg,3 mL)、PCX固相萃取柱(60 mg,3 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;UGC-24M氮吹儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;KQ-700GVDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 根據(jù)Portero-Otin法[9],色譜柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:水(0.1% TFA),流動相B:乙腈-水(1∶1,v/v),梯度洗脫程序:在1、10、30、35、40、45 min時流動相B的含量分別為0%、15%、20%、100%、0%,分析時間:45 min;流速:0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:室溫;紫外-可見光檢測器,檢測波長:298 nm。

1.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取5 mg吡咯素標(biāo)準(zhǔn)品用高純水定容至10 mL,配制成摩爾濃度為2×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再依次稀釋成2×10-3、1×10-3、5×10-4、2×10-4、1×10-4、5×10-5、2×10-5、1×10-5、5×10-6、2×10-6、1×10-6、5×10-7mol/L一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,4 ℃冰箱存放。

1.2.3 固相萃取 根據(jù)Yoshihara法[15],并進一步優(yōu)化實驗條件,將MCX柱、PCX柱、C18柱、HLB柱預(yù)活化(依次通過3 mL甲醇、3 mL水),取1 mL樣液上樣,然后用2 mL水洗滌,最后目標(biāo)物分別通過3 mL乙腈(1 mL/L TFA)、乙腈(2 mL/L TFA)、乙腈(10 mL/L TFA)、甲醇、甲醇(5%氨水)、甲醇(10%氨水)、甲醇(20%氨水)進行洗脫,而后氮吹干燥,并復(fù)溶于流動相中,通過0.22 μm濾膜過濾后按照1.2.1方法進行HPLC檢測。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 結(jié)合型吡咯素 稱取2 mg蛋白質(zhì)當(dāng)量樣品,加入硼酸鈉緩沖液(0.5 mol/L,pH9.2,500 μL)混合后至緩沖液濃度為0.2 mol/L。加入硼氫化鈉溶液(0.5 mol/L,0.1 mol/L NaOH配制,17.5 μL)后至硼氫化鈉溶液濃度為0.1 mol/L后,樣品在4 ℃下還原10 h后,加入60% TCA至TCA最終濃度為20%,7000×g離心10 min,蛋白質(zhì)沉降后用丙酮洗滌2次,并分別加入1 mL 的1、3、6 mol/L HCl、1、3、6 mol/L HAc,在110 ℃條件下水解24 h,然后氮吹干燥,將干燥的蛋白質(zhì)水解物復(fù)溶于1 mL高純水中[13-14]。

1.2.4.2 游離型吡咯素 稱取2 mg蛋白質(zhì)當(dāng)量的樣品,加入無水甲醇至甲醇最終濃度為75%,7000×g離心10 min后,將上清液通過固相萃取柱。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)取平行實驗的平均值(n=3),采用SPSS16.0,Excel軟件進行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流速的選擇

實驗研究了在梯度洗脫條件下,不同的流速對洗脫效果的影響。結(jié)果如圖1所示,隨著流速的增加,吡咯素的出峰時間提前,流速為1.200 mL/min 時的出峰時間最早,為21.332 min,其次是流速為1.000 mL/min,其出峰時間為21.690 min。出峰時間早可以節(jié)約流動相,并節(jié)省時間,但流速過大可能會損壞色譜柱,縮短泵和色譜柱的使用壽命,因此最佳流速設(shè)定為1.000 mL/min(n=3)，此時的色譜圖見圖2。

圖1 不同流速對出峰時間的影響Fig.1 Effects of different rates on the peak time

圖2 流速為1.000 mL/min時的色譜圖Fig.2 The spectrum of pyrraline underthe rate of 1.000 mL/min

2.2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

在最佳分離條件下,分別以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣,以峰面積對摩爾濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3所示,回歸方程為y=4.55×109x-4140.41,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999,表明在5×10-7～2×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)吡咯素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。此檢測條件下的檢出限為5×10-7mol/L(S/N=3),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.78%～7.51%。

圖3 吡咯素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of pyrraline

2.3 固相萃取洗脫液的優(yōu)化

通過實驗,比較了7種洗脫液對吡咯素的洗脫效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同的洗脫液對吡咯素有不同的洗脫能力,回收率范圍在38.6%～96.3%,見圖4。其中,甲醇-氨水的洗脫效果較好,均在94%以上,而乙腈-TFA組的回收率均<90%,可能是HLB固相萃取柱是由N-乙烯吡咯烷酮和親脂性的二乙烯基苯聚合而成,氨水中和了吡咯素結(jié)合的質(zhì)子,使其變?yōu)橹行?從而破壞了吡咯素與吸附劑間的庫侖力,而甲醇破壞了吡咯素與吸附劑上疏水基團之間的非極性相互作用,使吡咯素易被洗脫,因此,本實驗選擇甲醇(5%氨水)作為洗脫液,其回收率最高,為96.3%(n=3)。

圖4 洗脫液對吡咯素回收率的影響Fig.4 Influence of elution on the recoveries of pyrraline注:A.乙腈(1‰ TFA);B.乙腈(2‰ TFA);C.乙腈(1% TFA);D.甲醇;E.甲醇(5%氨水);F.甲醇(10%氨水);G.甲醇(20%氨水)。

2.4 固相萃取柱的選擇

由于食品中的吡咯素含量較低,且存在大量干擾物質(zhì),故HPLC法很難直接檢測吡咯素,因此有必要將食品組分進行固相萃取預(yù)除雜和富集[16],上樣液為1 mL,洗滌液為2 mL水,洗脫液為3 mL甲醇(5%氨水)。結(jié)果如圖5所示,HLB固相萃取柱的回收率最高,為75%,可能是由于HLB固相萃取柱的填料是親水-親脂聚合物,在較寬的pH范圍內(nèi)具有較好的萃取效果[17],其次是PCX柱,為69.39%,而C18柱的凈化效果最低,為13.99%,且當(dāng)C18柱中的液體流干時會嚴(yán)重降低洗脫效果[17],故后續(xù)實驗選擇HLB柱檢測實際樣品(n=3)。

圖5 固相萃取柱對吡咯素回收率的影響Fig.5 Influence of SPE columns on the recoveries of pyrraline

2.5 酸水解的優(yōu)化

由表1可知,隨著酸濃度增加,檢測到吡咯素含量增加,即蛋白質(zhì)的水解程度增加,這是由于酸濃度增加,即溶液中氫離子濃度增加,蛋白質(zhì)酰胺鍵被切斷的可能性增大,因此檢測到的吡咯素含量增加[18],當(dāng)用6 mol/L HCl進行水解時,吡咯素含量最高,故后續(xù)實驗選擇6 mol/L HCl水解實際樣品(n=3)。

表1 不同條件下酸水解后食品中的結(jié)合型吡咯素含量

2.6 實際樣品檢測

2.6.1 結(jié)合型吡咯素 利用HLB固相萃取柱和高效液相色譜儀,按照1.2.4.1的方法對8種樣品中的結(jié)合型吡咯素進行了檢測,由圖6可知,出峰時間為21.654 min的峰為吡咯素。由表2可知,6種樣品中檢測到了結(jié)合型吡咯素,不同樣品中的吡咯素含量有較大的差異,其中全脂奶粉中的蛋白質(zhì)含量較高,其與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的結(jié)合型吡咯素含量較高,分別達(dá)到了141.90 μg/g奶粉、131.73 μg/g奶粉,而牛奶中結(jié)合型吡咯素含量較少,分別為11.53 mL/L牛奶、12.49 mL/L牛奶,不同的加熱溫度、加熱時間使得產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中美拉德反應(yīng)的程度不同,因而晚期糖基化終末產(chǎn)物的生成量不同,致使吡咯素的含量有較大差異(n=3)。

圖6 全脂奶粉2的色譜圖Fig.6 The spectrum of whole milk powder 2

表2 固相萃取結(jié)合HPLC法測定食品中的結(jié)合型吡咯素含量

2.6.2 游離型吡咯素 利用HLB固相萃取柱和高效液相色譜儀,按照1.2.4.2的方法對8種樣品中的游離型吡咯素進行了檢測,結(jié)果見表3。由表3可知,奶粉和牛奶中未檢測到吡咯素,而咖啡和醬油中均含有吡咯素,是因為奶粉和牛奶中含有較多的蛋白質(zhì),與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng),生成的結(jié)合型吡咯素含量較高,而游離氨基酸較少,故未檢測到游離型吡咯素;而醬油加工過程中豆粕酸解產(chǎn)生了游離氨基酸[19-20],以及咖啡豆中的風(fēng)味前體物質(zhì)氨基酸,在高溫烘焙過程中參與了美拉德反應(yīng)[21],與還原糖反應(yīng)形成了晚期糖基化終末產(chǎn)物所致,其中絲滑拿鐵咖啡中游離型吡咯素含量最高,其次是老抽醬油(n=3)。

表3 固相萃取結(jié)合HPLC法測定食品中的游離型吡咯素含量

3 結(jié)論

食品基質(zhì)非常復(fù)雜,其中的痕量吡咯素難以準(zhǔn)確定量,本研究優(yōu)化了固相萃取的分離條件和高效液相色譜的分離條件,建立了固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中的痕量吡咯素,在5×10-7～2×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為5×10-7mol/L(S/N=3),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～7.51%。該方法可對吡咯素進行預(yù)富集、凈化和除雜,有效地縮短了檢測時間,操作簡便,靈敏度高,重復(fù)性好,可作為快速檢測食品中痕量吡咯素的方法,并為監(jiān)管部門提供吡咯素的檢測依據(jù),有一定的應(yīng)用價值。

[1]Stitt A W,Jenkins A J,Cooper M E. Advanced glycation end products and diabetic complications[J]. Expert Opinion on Investigational Drugs,2002,11:1205-1223.

[2]Li Y,Zhang Y,Chen C,et al. Establishment of a rabbit model to study the influence of advanced glycation end products accumulation on osteoarthritis and the protective effect of pioglitazone[J]. Osteoarthritis and Cartilage,2016,24(2):307-314.

[3]付全意.食品模擬體系糖化反應(yīng)過程中羧甲基賴氨酸的形成和抑制[D].廣州:華南理工大學(xué),2012.

[4]Miyata S,Monnier V. Immunohistochemical detection of advanced glycosylation end products in diabetic tissues using monoclonal antibody to pyrraline[J]. Journal of Clinical Investigation,1992,89(4):1102-1112.

[5]Sengl M,Ledl F,Severin T. Maillard-reaktion von rinderserumalbumin mit glucose hochleistung-flüssigkeitschromatographischer nachweis des 2-formyl-5-(hydroxymethyl)pyrrol-1-norleucins nach alkalischer hydrolyse[J]. Journal of Chromatography A,1989,463:119-125.

[6]蔡成崗,張慧,李赫,等.食品中高級糖基化終產(chǎn)物的研究進展[J].食品研究與開發(fā),2013,34(24):280-282.

[7]魏芹,劉乃豐.羧甲基賴氨酸的研究進展[J].東南大學(xué)學(xué)報·醫(yī)學(xué)版,2005(4):269-273.

[8]Peng X F,Ma J Y,Cheng K W.The effects of grape seed extract fortification on the antioxidant activity and quality attributes of bread[J].Food Chemistry,2010,119(1):49-53.

[9]Delatour T,Hegele J.Analysis of advanced glycation end products in dairy products by isotope dilution liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry.The particular case of carboxymethyllysine[J].Journal of Chromatography A,2009,1216(12):2371-2381.

[10]Zhang G,Huang G W.Determination of advanced glycation end products by LC-MS/MS in raw and roasted almonds(Prunus dulcis)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(22):12037-12046.

[11]Hull G L J,Jayne V W,Amesc J M,et al.N-(carboxymethyl)lysine content of foods commonly consumed in a Western style diet[J]. Food Chemistry,2012,131(1):170-174.

[12]Henle T,Axel A W,Klostermeyer H E. Maillard reactions in chemistry,food and health[M]. 1st edn. London：The Royal Society of Chemistry,1994,195-200.

[13]黃娟,楊俊青,陳松潤,等. HPLC法測定嬰幼兒配方乳粉中羧甲基賴氨酸[J].食品研究與開發(fā),2016,37(3):175-177.

[14]孫曉華,賴克強,黃軼群,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定油條中羧甲基賴氨酸[J].食品工業(yè)科技,2014,35(11):298-301,323.

[15]Yoshihara K,Kiyonami R,Shimizu Y,et al. Determination of urinary pyrraline by solid-phase extraction and high performance liquid chromatography[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2001,24(8):863-866.

[16]朱曉玲,葉飛,楊潔,等.固相萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中的有機酸[J].色譜,2010,28(10):945-949.

[17]賈妍艷,譚建華,徐晨,等. 固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定水中9種藥品及個人護理用品[J]. 色譜,2014,32(3):263-267.

[18]馬永全,胡林子,于新.酸法水解河蜆蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(11):288-290.

[19]張海珍. 釀造醬油發(fā)酵過程風(fēng)味變化規(guī)律及工藝優(yōu)化的研究[D].杭州:浙江工商大學(xué),2010.

[20]吳婷. 醬油發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的研究[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[21]董文江,張豐,趙建平,等. 云南不同地區(qū)生咖啡豆的風(fēng)味前體物質(zhì)研究[J].現(xiàn)代食品科技,2016,32(1):290-296.

Determination of trace pyrraline in food samples using solid- phase extraction and high performance liquid chromatography

LIU Hui-lin,MU Lin,CHEN Xiao-mo,WANG Jing*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China)

A solid phase extraction-high performance liquid chromatography for determination of pyrraline in food was established. Pyrraline was extracted from food material by a HLB-SPE column and analyzed by high performance liquid chromatography. Results showed that a good linear range from 5×10-7to 2×10-3mol/L with correlation coefficient of 0.9999 was obtained. The relative standard deviation were 0.78%～7.51%.The limit of detection was 5×10-7mol/L(S/N=3). The discussed method was simple and accurate and could be applied to the detection of trace pyrraline in food.

high performance liquid chromatography;solid phase extraction;pyrraline;detection

2016-05-06

劉慧琳(1987-)，女，博士，講師，研究方向：食品安全檢測，E-mail：liuhuilin@btbu.edu.cn。

*通訊作者:王靜(1976-)，女，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：wangjing@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31501559,31571940)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)22-0090-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.009