酸棗仁湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬β-catenin表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

田旭升，李欣，王瓏，張家瑞，郭宏偉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

?

酸棗仁湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬β-catenin表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

田旭升1，李欣1，王瓏2，張家瑞1，郭宏偉1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠模型海馬β-catenin表達(dá)的影響。方法：復(fù)制慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激抑郁大鼠模型，測(cè)定其體質(zhì)量、糖水消耗及行為學(xué)得分，采用Western-Blot檢測(cè)大鼠海馬中β-catenin的表達(dá)。結(jié)果：抑郁模型大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度減慢，糖水消耗減少，行為學(xué)測(cè)試分減少，海馬內(nèi)β-catenin表達(dá)減少，酸棗仁湯高劑量組可上調(diào)β-catenin的表達(dá)。結(jié)論：酸棗仁湯可增加β-catenin的表達(dá)，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，具有抗抑郁作用。

抑郁癥；酸棗仁湯；β-catenin

抑郁癥現(xiàn)作為一種危害嚴(yán)重的精神疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、易復(fù)發(fā)、自殺傾向等特點(diǎn)。WHO的全球疾病負(fù)擔(dān)合作研究預(yù)測(cè)，到2020年抑郁癥將成為全球第二位醫(yī)療疾患[1]。抑郁癥不僅使患者健康受到損害，生活質(zhì)量下降，而且給家庭，社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān)，因此抑郁癥已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)和醫(yī)療問(wèn)題?？梢?jiàn)，對(duì)抑郁癥的防治研究迫在眉睫。

中醫(yī)對(duì)抑郁癥的認(rèn)識(shí)與研究比較早，在治病方法與研究上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)[2-5]。中醫(yī)藥多環(huán)節(jié)，多靶點(diǎn)的藥理特點(diǎn)也越來(lái)越廣泛的應(yīng)用在抑郁癥的防治上[6-7]。酸棗仁湯出自《金匱要略》，具有顯著的療效[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制大鼠抑郁模型，從而觀察酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠海馬內(nèi)的β-catenin(β-鏈蛋白)表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(180±50)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK(黑)2014-0008，大鼠所需的專(zhuān)用飼料，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心所提供，高壓滅菌處理實(shí)驗(yàn)大鼠所需飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備

酸棗仁、茯苓、知母、甘草、川芎購(gòu)于哈爾濱人民同泰藥店，經(jīng)鑒定符合2015年版《中國(guó)藥典》。酸棗仁湯的劑量參考《金匱要略》原方為依據(jù)，按照常規(guī)方法煎煮制成水煎劑，濃縮至0.5 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。生理鹽水、氟西汀購(gòu)于哈爾濱人民同泰藥店;兔抗多克隆二抗PV6001、DAB顯色劑購(gòu)于北京中山公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

上海恒電熱恒溫箱、恒溫冰箱(日本三洋電器有限公司)；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(LDZ-2型)；電擊箱(北京醫(yī)科院藥研所)；石蠟切片機(jī)萊卡2135型(德國(guó))；美國(guó)moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)；電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子公司)；醫(yī)學(xué)數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)(麥奧迪克廈門(mén)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

將48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，根據(jù)體質(zhì)量和open-field評(píng)分，隨機(jī)分成空白組、模型組、氟西汀組、酸棗仁湯低、中、高劑量組，每組8只，于造模7天后，連續(xù)灌胃21天。大鼠給藥量，按人與大鼠等效劑量關(guān)系換算，按照10 ml/kg劑量，空白組和模型組給予0.9%蒸餾水灌胃，氟西汀組給予0.36 mg/ml氟西汀混懸液灌胃，酸棗仁湯低中高劑量組分別給予濃度為0.5 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml的酸棗仁湯灌胃，6組均每日灌胃1次。

2.2 抑郁模型復(fù)制

空白組每籠飼養(yǎng)8只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不接受任何刺激。其余組別的大鼠每籠1只進(jìn)行孤養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)的21天內(nèi)，進(jìn)行7種不同的慢性應(yīng)激，每天1種，相同的應(yīng)激刺激不連續(xù)應(yīng)用。應(yīng)激方法根據(jù)Banasr[10]方法略微改進(jìn)，具體包括：禁水12 h，禁食12 h，傾斜鼠籠，熱刺激，冰水游泳，潮濕飼養(yǎng)，晝夜顛倒。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 體質(zhì)量測(cè)量

于實(shí)驗(yàn)的第0，21天測(cè)量大鼠體質(zhì)量，觀察并測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量所發(fā)生的變化，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析體質(zhì)量與抑郁的顯著性關(guān)系。

2.3.2 糖水消耗試驗(yàn)

此實(shí)驗(yàn)利用大鼠對(duì)糖水的喜好，反應(yīng)大鼠內(nèi)源性快感缺失的程度。于實(shí)驗(yàn)的第0，21天開(kāi)始進(jìn)行，在進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)前24 h，對(duì)各組大鼠禁食、禁水，將大鼠的飲用水更換成1%濃度的蔗糖水，每瓶150 ml，做好稱(chēng)量計(jì)算，12 h后記錄所有瓶中蔗糖水量的剩余數(shù)值，做差值計(jì)算出糖水消耗量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.3.3 行為學(xué)檢測(cè)

于實(shí)驗(yàn)的第0，21天開(kāi)始進(jìn)行，于大鼠測(cè)量完體質(zhì)量后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，準(zhǔn)備測(cè)試裝置為長(zhǎng)、寬各1 m、高0.8 m的木箱，底部設(shè)置為25個(gè)16 cm×16 cm的小方格。檢測(cè)過(guò)程中要保證減少額外干擾，例如時(shí)間、溫度、光照、及環(huán)境噪音等的干擾。正式檢測(cè)前，操作者應(yīng)熟練掌握檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，減少人為誤差。計(jì)算得分由2人或2人以上的操作者完成，1人負(fù)責(zé)觀察記錄計(jì)時(shí)，1人負(fù)責(zé)記錄大鼠活動(dòng)得分。計(jì)算得分方式是：垂直活動(dòng)得分為前肢抬起、后肢直立為準(zhǔn)，計(jì)1分，水平活動(dòng)得分以大鼠四肢共同處于1個(gè)方格內(nèi)為準(zhǔn)，計(jì)1分。測(cè)量時(shí)，首先應(yīng)將大鼠放置在箱子中心處，統(tǒng)計(jì)3 min內(nèi)大鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)得分總和。

2.3.4 大鼠海馬β-catenin表達(dá)檢測(cè)

于實(shí)驗(yàn)第21天，大鼠稱(chēng)量體質(zhì)量及行為學(xué)測(cè)試后，快速斷頭剝離海馬，按照100 mg/ml加入200 μl RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑后勻漿；冰上靜止1 h，于4 ℃ 12 000 r/min離心30 min；提取上清液測(cè)定總蛋白濃度，置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆茫缓?5 μg總蛋白樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；TBST配制5%脫脂奶粉室溫封閉1 h加小鼠β-catenin單克隆抗體4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜；加入羊抗兔二抗，羊抗小鼠二抗室溫孵育2 h；孵育完后TBST漂白10 min×3次；將膜用P10-LightHRP化學(xué)發(fā)光液室溫孵育5 min后封入保鮮膜，暗室內(nèi)壓入膠片曝光顯影。每次檢測(cè)時(shí)都檢測(cè)β-actin，以β-catenin與內(nèi)參β-actin的灰比度進(jìn)行比較，對(duì)顯影結(jié)果進(jìn)行掃描，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)處理

3 結(jié)果

3.1 酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠模型體質(zhì)量的影響

結(jié)果見(jiàn)表1，第0天各組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，第21天后，與空白組相比 ，模型組體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，酸棗仁湯低，中劑量組體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)，酸棗仁湯高劑量組和氟西汀組體質(zhì)量顯著增加(P<0.01)。

組別n第0天第21天空白組8201.50±7.37245.38±7.4**模型組8198.00±4.89205.35±8.65ΔΔ氟西汀組8202.48±3.41241.28±5.42**酸棗仁湯低組8205.02±3.11230.30±4.29ΔΔ*酸棗仁湯中組8204.02±7.84234.05±9.52Δ*酸棗仁湯高組8204.63±3.12243.94±4.88Δ**

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01； 與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.2 酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠模型糖水消耗的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。第0天各組大鼠糖水消耗無(wú)明顯差異(P>0.05)。第21天后，與空白組相比，模型組糖水消耗量顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組糖水消耗量均明顯增加(P<0.05)。

組別n第0天第21天空白組885.53±7.52161.68±32.04**模型組883.55±8.6039.958±12.94ΔΔ氟西汀組880.28±8.55120.608±10.54*酸棗仁湯低組889.18±7.418102.73±38.38*酸棗仁湯中組888.828±7.358112.33±82.63*酸棗仁湯高組882.028±9.43108.13±23.62*

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01； 與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.3 酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠模型行為學(xué)的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。第0天，各組大鼠行為學(xué)得分無(wú)明顯差別(P>0.05)；第21天，與空白組相比，模型組行為學(xué)得分顯著降低(P<0.01)，出現(xiàn)類(lèi)似為抑郁癥的癥狀，從行為學(xué)角度證明抑郁癥模型造成功。與模型組相比，酸棗仁湯低，中劑量組行為學(xué)得分明顯升高(P<0.05)，酸棗仁湯高劑量組和氟西汀組行為學(xué)得分顯著升高(P<0.01)。

組別n第0天第21天空白組8102.73±12.8995.75±6.13**模型組8102.00±13.4424.51±6.02ΔΔ氟西汀組8110.24±12.3282.73±14.87**酸棗仁湯低組8104.25±7.6844.00±9.48ΔΔ*酸棗仁湯中組8111.52±11.8470.59±13.38Δ*酸棗仁湯高組8101.08±8.9898.25±14.41Δ**

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01； 與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.4 酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠模型海馬β-catenin相對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

結(jié)果見(jiàn)表4。與空白組相比，模型組大鼠海馬β-catenin相對(duì)蛋白表達(dá)水平顯著性降低(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀組、酸棗仁湯高、中劑量組大鼠海馬β-catenin相對(duì)蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

組別n(β-catenin/β-actin)×100%空白組43.06±0.56**模型組40.75±0.22ΔΔ氟西汀組42.72±0.10**酸棗仁湯低組41.56±0.26ΔΔ*酸棗仁湯中組42.13±0.98**酸棗仁湯高組42.58±0.37**

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.5 酸棗仁湯對(duì)抑郁大鼠模型海馬β-catenin的表達(dá)影響

結(jié)果見(jiàn)圖1。與空白組相比，模型組大鼠海馬β-catenin蛋白的表達(dá)條帶明顯變細(xì)，表明β-catenin蛋白表達(dá)減少；與模型組相比，各給藥組的蛋白條帶明顯變粗，表明β-catenin蛋白表達(dá)增多，說(shuō)明氟西汀組，酸棗仁湯各劑量組可改善β-catenin蛋白的表達(dá)。

圖1 各組大鼠模型海馬β-catenin與β-action的蛋白表達(dá)比較注：1.模型組；2.空白組；3.氟西汀藥組；4.酸棗仁湯低組；5.酸棗仁湯中組；6.酸棗仁湯高組。

4 討論

通過(guò)β-catenin的表達(dá)與抑郁癥的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路作為腦內(nèi)調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于細(xì)胞內(nèi)β-catenin的水平，Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵是胞質(zhì)中是否存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的β-catenin[11]。在神經(jīng)干細(xì)胞分化方面，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其穩(wěn)定活化的β-catenin基因能夠促進(jìn)神經(jīng)髓干細(xì)胞分化成為感覺(jué)神經(jīng)元。若β-catenin發(fā)生突變后，可導(dǎo)致感覺(jué)神經(jīng)元大量流失，說(shuō)明β-catenin在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化成感覺(jué)神經(jīng)元方面起到重要作用。海馬腦區(qū)β-catenin含量增加，能夠快速產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)[12]。

酸棗仁湯作為治療虛煩虛眠虛寐的經(jīng)典名方，具有有效的抗抑郁作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激抑郁大鼠模型，應(yīng)用酸棗仁湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬β-catenin的表達(dá)做了相關(guān)研究。結(jié)果表明模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度緩慢，糖水消耗較治療組減少，行為學(xué)測(cè)試得分減少。模型組大鼠海馬相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著性降低，其β-catenin的表達(dá)降低，而酸棗仁湯高劑量組可提高β-catenin的表達(dá)，優(yōu)于酸棗仁湯低、中劑量組，起到良好的抗抑郁作用。因此可認(rèn)為酸棗仁湯抗抑郁機(jī)制可能與促進(jìn)神經(jīng)元生存，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少腦損傷密切相關(guān)。

[1] 謝鴻宇,吳毅.抑郁癥治療的新進(jìn)展——海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層內(nèi)源性神經(jīng)再生[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(1):86-89.

[2] 王彥恒.中西醫(yī)結(jié)合論治抑郁障礙[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006.

[3] 陳婷婷，劉雅芳.基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的中國(guó)古代抑郁癥醫(yī)案用藥規(guī)律分析[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(3)：16-20.

[4] 吳全娥，高彥宇，李在斯，等.尖葉假龍膽與石菖蒲配伍抗抑郁的作用機(jī)理研究[J].中醫(yī)藥信息，2016,33(3):72-74.

[5] 葉陽(yáng)，王睿，溫萍，等.抑郁癥的中醫(yī)臨床治療研究概況[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014，42(5)：99-101.

[6] 楊書(shū)彬，楊紹杰，盧春雪，等.中藥開(kāi)心散抗抑郁癥的機(jī)制研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(1)：79-81.

[7] 張浩，高瀟，柴劍波.愈癲湯治療痰氣郁結(jié)型抑郁患者的臨床觀察[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(4)：110-112.

[8] 田旭升，宋琳，馬伯艷，等.酸棗仁湯對(duì)慢性應(yīng)激所致抑郁癥模型大鼠腦保護(hù)作用的研究[J].中醫(yī)藥信息，2014,31(3):47-49.

[9] 張斌，張喬，馬英男.慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用[J].中醫(yī)藥信息，2014,31(4):126-129.

[10] Banasr M, Duman RS. Regulation of neurogenesis and gliogenesis by stress and antidepressant treatment [J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2007,6(5):311-320.

[11] Kaidanovich-Beilin O, Milman A,Weizman A,et al.Rapid antidepressive-like activity of specific glycogen synthase kinase-3 inhibitor and its effect on β-catenin in mouse hippocampus[J]. Biological psychiatry,2004,55(8):781-784.

[12] 許晶.慢性應(yīng)激抑郁模型的建立及其評(píng)價(jià)[J].中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2003,12(1):14-17.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81303044)

田旭升(1976-)，男，博士，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥干預(yù)精神疾病。

郭宏偉*(1966-),男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，醫(yī)學(xué)博士，主要研究方向：中國(guó)醫(yī)學(xué)史，中國(guó)醫(yī)學(xué)現(xiàn)代轉(zhuǎn)型研究中精神疾病相關(guān)研究。

2016-08-30

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0052-03

修回日期：2016-09-10