HPLC法同時(shí)測定杜仲葉中4種成分的含量

王學(xué)軍，梁旭華，徐恒

(陜西省商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

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HPLC法同時(shí)測定杜仲葉中4種成分的含量

王學(xué)軍，梁旭華，徐恒

(陜西省商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測定杜仲葉中4種成分含量的方法。方法：采用C18色譜柱(200mm×4.6mm，10μm)，以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫(甲醇：0～2min，22%；2～6min，22～60%；6～20min，60%；20～24min，60～22%；24～28min，22%)；流速0.8mL/min；柱溫30℃；檢測波長綠原酸為327nm，蘆丁、槲皮素、山奈酚為360nm。結(jié)果: 綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚進(jìn)樣量分別在16.4～98.4μg/mL，15.6～93.6μg/mL，15.18～91.07μg/mL，15.7～94.2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為101.0%、98.6%、102.9%、103.3%。結(jié)論：建立的方法符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，可用于杜仲葉中綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種成分的含量測定。

杜仲葉；綠原酸；蘆??；槲皮素；山奈酚；高效液相色譜法

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國特有的名貴中藥材，傳統(tǒng)以樹皮入藥,但樹皮資源十分有限，難以滿足臨床的需求，研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉與皮含有相似的藥用有效成分，如黃酮類、苯丙素類、木脂素類和環(huán)烯醚萜類等，而且藥理作用基本一致，均具有降血壓、降血脂、抗衰老、抗癌防癌、利尿、安胎等作用[1]，作為中藥材杜仲葉在2010版、2015版《中國藥典》中均有收載[2]。但《中國藥典》2015版僅通過測定綠原酸一種成分含量的方法來控制杜仲葉的質(zhì)量，難以全面地反映藥材的整體質(zhì)量。本文在參考前人研究的基礎(chǔ)上[3-4]，建立了直接測定杜仲葉中綠原酸、蘆丁和水解后測定槲皮素、山奈酚4種成分的定量分析方法，提高了杜仲葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為杜仲藥材及其制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

HH-6型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；LC-20A型反相高效液相色譜儀(四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測器)(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)。

蘆丁對照品(批號(hào)080-9002,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、槲皮素對照品(批號(hào)100081-200406,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.3%)(中國藥品生物制品鑒定所)；綠原酸對照品(批號(hào)20150905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、山奈酚對照品(批號(hào)20151122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)(上海金瑞生物科技有限公司)；杜仲葉購于陜西普田源杜仲藥材種植基地；殼聚糖(鄭州天和生物科技有限公司)；甲醇、磷酸(色譜純)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，10 μm)；以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫(甲醇：0～2 min，22%；2～6 min，22～60%；6～20 min，60%；20～24 min，60～22%；24～28 min，22%)；進(jìn)樣量10 μL；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；檢測波長綠原酸為327 nm，蘆丁、槲皮素、山奈酚為360 nm。結(jié)果見圖1。

圖1 對照品(A)與杜仲葉樣品HPLC圖譜(B:327 nm;C:360 nm)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品3.9 mg、槲皮素對照品15.6 mg、山奈酚對照品15.7 mg、綠原酸對照品16.4 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 綠原酸和蘆丁的測定

杜仲葉樣品粉碎過4號(hào)篩，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，超聲(100 W，頻率100 kHz)提取2次，每次30 min，合并濾液至50 mL的容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.3.2 槲皮素和山奈酚的測定

杜仲葉樣品粉碎過4號(hào)篩，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，超聲(100 W，頻率100 kHz)提取2次，每次30 min，回收溶劑后得到浸膏，向浸膏中加甲醇200 mL、6 mol/L鹽酸溶液50 mL，80℃水浴回流水解4 h，再回收溶劑，用70%甲醇定容至100 mL容量瓶，超聲震蕩30 min使溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到綠原酸、蘆丁、槲皮素和山奈酚的回歸方程分別為：

Y綠原酸=39.71X-59.92(R2=0.999 4)

Y蘆丁=20.95X-51.36(R2=0.999 1)

Y槲皮素=54.67X-11.469(R2=0.999 6)

Y山奈酚=507.28X-43.357(R2=0.999 7)

表明綠原酸濃度在16.4～98.4 μg/mL，蘆丁濃度在3.9～23.4 μg/mL，槲皮素濃度在15.6～93.6 μg/mL，山奈酚濃度在15.7～94.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測定并計(jì)算綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD，結(jié)果表明RSD分別為1.4%、1.6%、1.4%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于 0、2、5、10、16、24 h進(jìn)樣10 μL，計(jì)算各成分峰面積的RSD，結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.0%、1.9%、1.8%、1.5%。結(jié)果表明供試品溶液中上述4種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取杜仲葉同一樣品5份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分含量的RSD。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚含量的RSD分別為1.1%、0.9%、1.5%、2.2%。表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6 份已測含量的陜西商州杜仲葉粉末適量，精密加入適量的綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 樣品測定

用上述分析方法分析陜西6產(chǎn)地的樣品，計(jì)算各樣品4種待測成分的含量，結(jié)果見表2。測定結(jié)果顯示，陜西5個(gè)產(chǎn)地的杜仲葉，其商州杜仲葉中各成分的總含量最高，達(dá)到2.008%，質(zhì)量最佳。

表2 樣品測定結(jié)果(%)

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本文試驗(yàn)考察了超聲提取法、微波提取法、熱水回流提取法對4種成分的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示超聲提取法較其他方法而言提取時(shí)間大大縮短，產(chǎn)率也較高，而且超聲提取法可在室溫下進(jìn)行，設(shè)備簡單，操作方便。因此本文選用超聲提取法進(jìn)行杜仲葉的提取。

3.2 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙醇、水等提取溶劑對提取效果的影響，結(jié)果表明甲醇對這4種成分的提取效果較好。在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇超聲提取時(shí)間、液料比、甲醇濃度3個(gè)因素，采用 L9( 34) 正交表，以4種成分的總提取率為考察指標(biāo)，對杜仲葉的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。最終得到杜仲葉的最佳提取工藝為: 50倍量的70%甲醇超聲提取30 min，在此優(yōu)化工藝條件下，對超聲提取次數(shù)也進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示提取2次基本可以提取完全。

3.3 樣品的前處理

本文在測定杜仲葉中這4種成分的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果不水解直接測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素和山奈酚的含量極低，但將杜仲葉的提取液在酸性條件下進(jìn)行水解后再測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素和山奈酚的含量提高有20倍之多，這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明杜仲葉中游離的槲皮素和山奈酚的含量極低。但水解時(shí)由于蘆丁為苷類化合物，綠原酸分子結(jié)構(gòu)中有一酯鍵官能團(tuán)，在酸性條件下，這兩種成分都能發(fā)生水解反應(yīng)而使它們的含量測定結(jié)果偏低，所以本文采用兩步法分別測定了綠原酸、蘆丁和槲皮素、山奈酚的含量。

[1] 周云雷,郭婕,王志宏,等. HPLC 法同時(shí)測定矮林杜仲葉中6種成分含量[J].中藥材,2015,38(3):540-543.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[3] 張欣,張春鳳.HPLC同時(shí)測定杜仲葉中7種成分的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,43(5):435-437.

[4] 王志宏，周云雷，彭勝,等.HPLC法同時(shí)測定水解前后杜仲葉黃酮苷元的含量[J].應(yīng)用化工,2014,43(5):950-956.

Simultaneous Determination of Four Compounds in Leaves of Oliv. by HPLC

WANG Xue-jun,LIANG Xu-hua,XU Heng

(CollegeofBiomedicalandFoodEngineering,ShangluoUniversity,Shangluo726000,China)

Objective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of the contents of 4 compounds in the leaves of Oliv..Methods: C18column(200 mm×4.6 mm,10 μm)was adopted.The mobile phase was methanol-1% phosphoric acid solution with gradient elution(methanol：0-2 min，22%；2-6 min，22-60%；6-20 min，60%；20-24 min，60-22%；24-28 min，22%)at a flow rate of 0.8 mL/min and the temperature of column was kept at 30℃.Results: Chlorogenic acid,rutin,quercetin and kaempferol had a good linear relationship in the range of 16.4～98.4,15.6～93.6,15.18-91.07 and 15.7-94.2 μg/mL,and the average recoveries of 4 compounds were 101.0%,98.6%,102.9% and 103.3%,respectively.Conclusion:This method conforms to the validation requirement of methodology,and it can be used for the content determination of chlorogenic acid,rutin,quercetin and kaempferol in the Eucommia ulmoides leaves.

Leaves of Eucommia ulmoides；Chlorogenic acid；Rutin；Quercetin；Kaempferol；HPLC

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2014JM4097)；陜西省教育廳項(xiàng)目(No.2013JK0836)；商洛市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃專項(xiàng)(No.SK2014-01-12)；商洛學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(No.12sky0016)；陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心科研基金(No.QBXT-Z(P)-15-19)

王學(xué)軍(1975-)，男，副教授，博士，主要從事中藥有效成分分離分析、結(jié)構(gòu)修飾及新藥開發(fā)研究工作。

2016-05-12

R

A

1002-2406(2017)01-0033-03

修回日期：2016-06-01