呂嘉櫪， 張軍蒙， 余 芳， 田延楚

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

具有α-葡萄糖苷酶抑制性益生乳酸菌的篩選

呂嘉櫪， 張軍蒙， 余 芳， 田延楚

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

通過對從發(fā)酵果蔬中初篩得到的18株乳酸菌益生性能中的產(chǎn)酸、耐受人工胃腸液能力的研究，得出18株乳酸菌所產(chǎn)總酸為0.8%到3.2%之間，其中有2株植物乳桿菌的總酸在3%以上，3株乳酸菌在1%以下.模擬人體內(nèi)環(huán)境進行人工胃液、腸液耐受性實驗中，存活率低于20%的有3株菌株，其余15株菌存活率都處于20%以上的水平.接下來進行α-葡萄糖苷酶抑制性研究，最終檢測到這18種益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶都有不同的抑制效果，從5.71%到37.48%不等，其中抑制率最高的乳雙歧桿菌1號菌株達(dá)到了37.48%，最低的為鼠李糖乳桿菌1號為5.71%.最終篩選出乳雙歧桿菌1號菌株、干酪乳桿菌2號菌株、植物乳桿菌2號菌株、未培乳酸菌1號菌株為具有良好益生特性與α-葡萄糖苷酶抑制性的4株益生乳酸菌.

乳酸菌； 人工胃液； 人工腸液；α-葡萄糖苷酶

0 引言

益生菌( Probiotics) 是指經(jīng)攝取適當(dāng)量后通過改善腸道菌群平衡對宿主的身體健康發(fā)揮有效作用的活性微生物[1].益生菌的益生特性包括很多種，其中對胃腸液的耐受性是其比較基本的益生特性，乳酸菌作為益生菌中代表性的分支在自然界中大量存在，乳酸菌產(chǎn)生的有機酸能降低腸道內(nèi)的pH和Eh(氧化還原電勢)，使腸道處于酸性環(huán)境[2]，但只有具備胃腸液耐受性的乳酸菌才能定植在人體的腸道中.所以篩選出具有胃腸液耐受性的乳酸菌是益生乳酸菌研究的一個重要方面.

有的益生乳酸菌由于對小腸上的α-glucosidase活力有抑制作用，可延緩碳水化合物的消化和吸收，從而降低餐后高血糖[3].近年來，已有許多種益生乳酸菌被證實當(dāng)應(yīng)用于動物模型和臨床試驗中對糖尿病具有預(yù)防或治療的作用.益生乳酸菌有利于控制體內(nèi)葡萄糖代謝過程中相關(guān)產(chǎn)物的分解與合成，維持機體血糖平衡[4].益生乳酸菌引起了越來越多國內(nèi)外研究者的青睞，具有巨大的研究價值和應(yīng)用潛力.但目前國內(nèi)對于乳酸菌降糖作用的研究較少[5]，所以篩選具有α-葡萄糖苷酶抑制性作用的益生乳酸菌對于益生乳酸菌的降血糖作用研究能夠提供一定的基礎(chǔ).

本研究對從陜西、甘肅等地區(qū)采集的自然發(fā)酵產(chǎn)品如發(fā)酵果蔬、發(fā)酵乳樣品篩選分離得到的18株乳酸菌，模擬人體內(nèi)環(huán)境測試其對人工胃液與人工腸液的耐受性及產(chǎn)酸特性.通過改進反應(yīng)體系后研究益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶的抑制性，從而篩選出具有α-葡萄糖苷酶抑制性作用的益生乳酸菌.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用菌株

從陜西、甘肅等地區(qū)采集的自然發(fā)酵產(chǎn)品如發(fā)酵果蔬、發(fā)酵乳樣品初篩得到18株乳酸菌，植物乳桿菌1號(Lactobacillusplantarum簡稱LP01)，植物乳桿菌2號(Lactobacillusplantarum簡稱LP02)，植物乳桿菌3號(Lactobacillusplantarum簡稱LP03)，植物乳桿菌4號(Lactobacillusplantarum簡稱LP04)，嗜酸乳桿菌1號(Lactobacillusacidophilus簡稱LA01)，鼠李糖乳桿菌1號(Lactobacillusrhamnosus簡稱LCR01)，未培乳酸菌1號(Unculturedlactobacillus簡稱UL01)，未培乳酸菌2號(Unculturedlactobacillus簡稱UL02)，保加利亞乳桿菌1號(Lactobacillusbulgaricus簡稱LB01)，糞鏈球菌1號(Enterococcusfaecalis簡稱EF01)，副干酪乳桿菌1號(Lactobacillusparacasei簡稱LCP01)，干酪乳桿菌1號(Lactobacilluscasei簡稱LC01)，干酪乳桿菌2號(Lactobacilluscasei簡稱LC02)，嗜熱鏈球菌1號(Streptococcusthermophilus簡稱ST01)，哈爾濱乳桿菌1號(Lactobacillusharbinensis簡稱LH01)，哈爾濱乳桿菌2號(簡稱LH02)，羅伊氏乳桿菌1號(Lactobacillusreuteri簡稱LR01)，乳雙歧桿菌1號(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis簡稱BA01).陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

(1)培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基.

(2)試劑：胃蛋白酶(1∶10 000)、胰蛋白酶(1∶250)，來源于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶(10萬u/g)，對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG).

1.1.3 儀器與設(shè)備

Leica-DM750生物顯微鏡，AC-0629普通光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺，XW.80A旋渦混合器，DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱，LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，UV-2600紫外可見分光光度計，HC-3018R冷凍離心機，pH計，恒溫水浴箱， MK3酶標(biāo)儀.

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌益生性能的研究

(1)酸度的測定：接種1%的菌種后48 h后用0.1 mol/L NaOH進行滴定后換算酸度，計算方法參考文獻[6].

(2)乳酸菌在體外模擬人體胃腸環(huán)境耐受性試驗樣液：人工胃液與人工腸液依據(jù)中國藥典進行制備[7].

①乳酸菌耐受人工胃液試驗：將制取的菌懸液調(diào)整至109cfu/mL，取1 mL加入9 mL制取的人工胃液中[8]，充分混勻后取1 mL混合液稀釋到一定梯度，使用高層瓊脂柱法測其0 h的活菌數(shù)，同時放置于37 ℃下培育3 h后取出，再次測其活菌數(shù)，通過與0 h的活菌數(shù)之比計算出存活率.公式如下：

100%

(1)

②乳酸菌耐受人工腸液試驗：將上述在人工胃液里培育3 h后的乳酸菌菌液吸取1 mL加入9 mL的人工腸液中并在37 ℃下培育，使用高層瓊脂柱法[8]，分別測定其在0 h、2 h、6 h的活菌數(shù)，與0 h的活菌數(shù)進行對比，同上計算其存活率.

100% (n=2、6)

(2)

1.2.2 益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶抑制性研究

(1)α-葡萄糖苷酶抑制性試驗反應(yīng)體系的確定

首先使用紫外分光光度計進行測定，最后再等比例縮小反應(yīng)體系.

①底物濃度的確定：確定反應(yīng)體系為3.5 mL，其中1 mLPBS，將底物1mLPNPG濃度稀釋為以下梯度，25、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5 mmol/L,體系中其它條件暫定，20 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液0.5 mL，反應(yīng)30 min后加1 mL1 moL/L Na2CO3終止反應(yīng)1 min，在405 nm下測其OD值.

②酶液用量的確定：酶活力20 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，在以上反應(yīng)體系中加酶液量分別為：0.3,0.4,0.5,0.6,0.7 mL，反應(yīng)30 min后再在405 nm下測其吸光度.

③反應(yīng)時間的確定：分別在反應(yīng)10、20、30、40、50 min后再在405 nm下測其OD值.

④菌體濃度的確定：確定以上條件后，其他條件不變，每株乳酸菌將制取的菌懸液密度分別調(diào)整為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu/mL，測試每株菌在濃度為多少時可以使吸光度值在以上反應(yīng)體系中達(dá)到可置信區(qū)間.

(2)益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶抑制性試驗

①菌懸液的制備：將篩選出的菌種接種到液體MRS培養(yǎng)基中進行連續(xù)活化三代后使用，然后在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min溫度為4 ℃的條件下進行離心10 min，倒掉上清液取沉淀用0.85%的生理鹽水進行重懸，制取菌懸液.

②確定了反應(yīng)體系后等比縮小反應(yīng)體系，按照計量順序添加反應(yīng)物，在總體積210μL的體系中，添加50μL PBS(0.1 mol/L pH6.8)，再加入50μL 20 mmol/L的對硝基苯酚-α-D-吡喃葡葡糖苷(PNPG)溶液及25μL待測乳酸菌的菌懸液，將混合物于37 ℃孵化10 min，加入30μLα-葡萄糖苷酶溶液20 U/mL繼續(xù)反應(yīng)20 min，加入50μL 1 mol/L Na2CO3作為反應(yīng)終止液，將反應(yīng)液于405 nm處測其吸光值，吸光值與對硝基苯酚PNP的游離量成正比，反應(yīng)體系中采用pH6.8的0.1 mol/L PBS作為α-葡萄糖苷酶溶液及待測樣品的空白對照，進行反應(yīng)后計算益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶抑制性，其抑制率計算公式如下：

α-葡萄糖苷酶酶活抑制率(%)=

(3)

式(3)中：A為樣品組含有樣品溶液以及α-葡萄糖苷酶溶液；B為樣品空白組含有樣品溶液不含α-葡萄糖苷酶溶液；C為對照組不含有樣品溶液含α-葡萄糖苷酶溶液；D為空白組不含有樣品溶液以及α-葡萄糖苷酶溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的益生特性的研究

2.1.1 產(chǎn)酸特性的研究

菌株以1%的接種量接種之后，48h后測定其發(fā)酵液的總酸，通過每株菌產(chǎn)酸量對比得出該菌的產(chǎn)酸特性，其結(jié)果如圖1所示.

圖1 菌株培養(yǎng)液48 h酸度

從圖1中可以看出，18株菌株在48 h的產(chǎn)酸能力，菌株48 h的產(chǎn)酸試驗中，LC01與LC02的總酸均在3%以上，屬于高產(chǎn)酸性乳酸菌[9]，菌株48 h產(chǎn)酸能力較低的有EF01、ST01、BA01、LH01四株菌株.產(chǎn)酸能力也是益生菌益生性能評價的一個重要指標(biāo)[10]，所產(chǎn)的酸可以使腸道pH降低，并且可以有效地抑制腸道內(nèi)有害菌群的生長.產(chǎn)酸能力可作為篩選具有α-葡萄糖苷酶抑制性作用的益生乳酸菌的一個參考指標(biāo).

2.1.2 乳酸菌耐受人工胃液研究

將1 mL菌懸液加入9 mL人工胃液之后，分別在0 h和3 h測定其活菌數(shù)，存活率的結(jié)果如圖2所示.

圖2 菌種耐受人工胃液

菌株耐受胃液能力的試驗中，EF01和LR01存活率分別為8.37%與17.75%，剩余16株乳酸菌存活率均在20%以上，活菌數(shù)均在108cfu/mL以上.菌株LB01、LA01、LGG01存活率均達(dá)到了60%以上.菌株進入消化道之后，胃液中較低的pH會使一部分菌體死亡，而菌株進入腸道定植是其發(fā)揮作用的前提，所以存活率越高的菌株越有發(fā)揮作用的可能.通過體外模擬人體腸胃液的試驗可以篩選出較有價值的菌株[11].

2.1.3 乳酸菌耐受人工腸液研究

將從人工胃液培育之后的菌株胃液混合液1 mL加入9 mL人工腸液，分別在0 h、2 h、6 h測定其活菌數(shù)，存活率的結(jié)果如圖3所示.

圖3 菌種耐受人工腸液結(jié)果

由圖3中可知，菌株耐受腸液能力的試驗中，EF01菌株2 h和6 h的存活率分別為15.38%和10.73%，LCP01分別為6.67%與2.16%，剩余16株乳酸菌存活率均在20%以上，活菌數(shù)均在108cfu/mL以上.菌株LB01、ST01、LH02存活率均達(dá)到了75%以上.

在以上模擬人體內(nèi)環(huán)境耐受性試驗中，EF01對于胃液與腸液耐受性均比較敏感.LCP01對于人工胃液耐受性一般，對于人工腸液較為敏感，6 h存活率僅為2.16%，LR01耐受胃液能力較低為17.75%.

2.2 益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶抑制性研究

2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制性試驗反應(yīng)體系的確定

(1)底物濃度的確定

從圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到20 mmol/L后吸光度值不再增加，所以20 mmol/L為該體系底物濃度.

圖4 底物濃度

(2)酶液量的確定

由圖5可知，當(dāng)酶液量達(dá)到0.6 mL時其吸光度值基本保持穩(wěn)定，選擇0.6 mL為體系中的酶液量.

圖5 酶液量

(3)反應(yīng)時間的確定

由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)時間超過30 min后其OD值基本保持不變，所以選擇30 min為其體系反應(yīng)時間.

圖6 反應(yīng)時間

(4)乳酸菌的菌體反應(yīng)濃度的確定

在以上確定的反應(yīng)條件下，通過試驗得出菌種BA01與LH02的菌體反應(yīng)濃度為107cfu/mL，其余16株菌種菌體反應(yīng)濃度均在109cfu/mL.此濃度下在體系中吸光度值可以達(dá)到置信區(qū)間.

2.2.2 菌株對α-葡萄糖苷酶抑制性研究

按照確定好的反應(yīng)體系后，依照計量順序依次加入反應(yīng)物反應(yīng)后計算菌株對α-葡萄糖苷酶抑制率，其結(jié)果如圖7所示.

圖7 乳酸菌菌體對α-葡萄糖苷酶抑制率

乳酸菌通過人體胃腸液的考驗，最終定植于人體腸道內(nèi)，其活的菌體對小腸上的α-glucosidase活力的抑制，可延緩碳水化合物的消化和吸收，從而降低餐后高血糖，其作用是最直接的[12].從表1可以看出這18株乳酸菌在不同程度上對于α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，在這18株菌株里面BA01菌株對α-葡萄糖苷酶抑制率最高，達(dá)到了37.48%，其次是LC012菌株為33.79%，LP02與UL01分別為30.79%與30.52%，這4株益生乳酸菌抑制率均達(dá)到了30%以上.

3 結(jié)論

益生乳酸菌占已開發(fā)的益生菌數(shù)量的絕大部分，其益生性能是多種多樣的[13]，本研究對從傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中篩選到的乳酸菌進行了一系列的測試，通過對這18株菌模擬人體內(nèi)環(huán)境進行的人工腸胃液耐受性實驗中，可以看出EF01對于胃液與腸液耐受性均比較敏感.LCP01對于人工胃液耐受性一般，對于人工腸液較為敏感，6 h存活率僅為2.16%，LR01耐受胃液能力較低為17.75%，其余15株菌對于胃液與腸液的耐受性都處20%以上的存活率的水平，活菌數(shù)在1×108 cfu/mL以上.Gillilands等[14]研究認(rèn)為攝入1×106cfu/mL及以上的益生乳酸菌就可改善腸道微生物平衡，發(fā)揮益生作用.最終檢測到這18種益生乳酸菌對α-葡萄糖苷酶都有不同的抑制效果，從5.71%到37.48%不等，這與陳佩等[15]所篩選出的1株具有潛在降糖作用的干酪乳桿菌CCFM0412對α-葡萄糖苷酶抑制率為29.61%相比略高.也比商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌GG 29.31%的抑制率略高.

益生乳酸菌發(fā)揮作用的前提是對人體胃腸液有良好的耐受性，在益生乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制性研究中綜合考慮，選取耐受性良好且對α-葡萄糖苷酶抑制能力強的乳酸菌菌株進行后續(xù)研究，篩選出BA01菌株、LC02菌株、LP02菌株、UL01菌株為最終具有良好益生性能與α-葡萄糖苷酶抑制性的4株益生乳酸菌.本研究為具有降血糖能力的益生菌的篩選研究提供了一定的基礎(chǔ)，乳酸菌產(chǎn)酸能力與降血糖的關(guān)系也可作為后期研究的一個方向，對于其降血糖其他方面的能力與其機理的研究還需進一步深入探究.

[1] 周凌華,王 豪,王蔭榆,等.功能性益生乳酸菌的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(7):990-997.

[2] 郭志杰.仔豬源乳酸菌的篩選及其對仔豬作用的影響[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[3] 范文婭,吳正鈞,郭本恒.乳酸菌的降血糖作用研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(9):1 323-1 329.

[4] 丁武蓉.青藏高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶中乳酸菌多樣性及其益生功能研究[D].蘭州：蘭州大學(xué),2014.

[5] 陳 佩.益生乳酸菌的降糖作用及其機制的研究[D].無錫：江南大學(xué),2014.

[6] 趙 婧,李 慧,周春麗,等.高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選、鑒定和生長特性研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(3):173-176.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部[M].京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[8] 王立平.內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸馬奶酒中乳桿菌潛在益生特性的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[9] 馬春麗,張?zhí)m威.高產(chǎn)酸性能乳酸菌的篩選及產(chǎn)酸機理研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(1):189-190.

[10] 李莉媛.19株飼用益生菌體外性能評價及優(yōu)良菌株的篩選[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2012.

[11] Vinderola C G,Reinheimer J A,Farnworth E R.Lactic acid starter and probiotic bacteria:A comparative “in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistance[J].Food Research International,2003,36(9-10):895-904.

[12] 肖 榮,王遠(yuǎn)亮,李宗軍.益生性乳酸菌黏附性研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(5):134-137.

[13] 林鴻佳.具有α-糖苷酶抑制作用的啤酒糟多肽的分離及其作用機理研究[D].廣州：華南理工大學(xué),2013.

[14] Gilliland S E,Walker D K.Factorsto consider when selecting a culture ofLactobacillusacidophilusas a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans[J].J Dairy Sci,2003,73(4):905-911.

[15] 陳 佩,黨 輝,張秋香,等.1株具有潛在降糖作用的益生菌的篩選[J].中國食品學(xué)報,2014,14(11):27-33.

【責(zé)任編輯：陳 佳】

Screening of probiotic lactic acid bacteria withα-glucosidase inhibition activity

LV Jia-li, ZHANG Jun-meng, YU Fang, TIAN Yan-chu

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

The eighteen lactic acid bacteria strains which preliminary screening from the fermentation of fruits and vegetables,by research on their prebiotic properties of acid production ability and withstand artificial gastrointestinal fluid ability,we found that total acid amount produced by 18 lactic acid bacteria strains was between 0.8% to 3.2%,Which have two lactic acid bacteria strains total acid amount more than 3%,three lactic acid bacteria strains were below 1%.In the research of tolerance with simulation environment of the human artificial gastric juice and intestinal juice test,we found that the survival rate of three strains was less than 20%,the remaining 15 strains survival rate are more than 20%.Then wasα-glucosidase inhibition study,we finally detected that this 18 lactic acid bacteria strains have differentα-glucosidase inhibition activity,ranging from 5.71% to 37.48%,the highest inhibition rate wasBifidobacteriumanimalissubsp.lactisNo.1 which reached 37.48%,the lowest forLactobacillusrhamnosusNo.1 was 5.71%.Finally we selected four probiotic lactic acid bacteria strains have good probiotic properties andα-glucosidase inhibition activity which wereBifidobacteriumanimalissubsp.lactisNo.1,LactobacilluscaseiNo.2,LactobacillusplantarumNo.2,UnculturedlactobacillusNo.1.

lactic acid bacteria; artificial gastric juice; artificial intestinal juice;α-glucosidase

2016-09-27

陜西省科技廳科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2011KTCQ03-08)； 咸陽市科技計劃項目(2013K06-09)

呂嘉櫪(1964-)，女，陜西三原人，教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)

1000-5811(2017)01-0129-05

O939.99

A