大鼠腦缺血再灌注早期血腦屏障通透性的變化

楊明坤，司明文，趙寶東

(1遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，錦州 121001；2茌平縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，聊城 252100；3聊城市人民醫(yī)院急診科，聊城 252001)

缺血性腦血管疾病具有較高的發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅著人們的健康。腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的發(fā)生也是困擾臨床醫(yī)師的難題。諸多研究表明，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)結(jié)構(gòu)和功能的改變是I/R的一個重要病理過程，BBB通透性增加將加重缺血腦組織損傷。但是，這些研究大多集中在腦缺血2 h、再灌注2 h以后的時間段，而對腦缺血2 h、再灌注2 h以內(nèi)的BBB通透性變化還鮮有報道。為探討大鼠局灶性腦I/R早期BBB通透性的變化，本研究利用I125-神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)作為示蹤劑，檢測大鼠局灶性腦I/R模型早期BBB的變化。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

SD成年雄性大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，購于遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心[合格證號：SCXK(遼)2005-0003]。采用隨機數(shù)字表法，將大鼠分為6組：假手術(shù)(Sham)組，缺血1 h組，缺血2 h組，缺血2 h再灌注0.5 h組，缺血2 h再灌注1 h組和缺血2 h再灌注2 h組，每組5只。

Iodogen由第三軍醫(yī)大學(xué)核醫(yī)學(xué)室提供。NGF由大連斯威特制藥公司提供。碘化鈉(NaI125)購自中國原子能研究所。

1.2 方法

1.2.1125I與NGF的結(jié)合及分離純化 在柴彪新等[1]方法的基礎(chǔ)上進行適當(dāng)改良。1 mg Iodogen溶于0.5 ml氯仿中，取100 μl加至試管底部，氮氣吹干。另配制含NaCl(0.2 mol/L)的乙酸(0.01 mol/L)緩沖液(pH 5.4)，取適量NGF加入緩沖液，使其濃度為3 g/L。取1 ml NGF緩沖液加入Iodogen試管，再加入NaI125(4.0 mCi)，20℃反應(yīng)12 min后，經(jīng)Sephaeryls-200HR凝膠柱層析(內(nèi)徑1.0 cm，高50 cm)，洗脫液為含NaCl(0.2 mol/L)的乙酸(0.01 mol/L)緩沖液(pH 5.4)。收集第1峰的洗脫液，γ計數(shù)器(FJ-2003/50)測定已純化125I-NGF(10 μl)的放射性，然后加入三氯乙酸(200 g/L)200 μl，混勻離心，棄上清，沉降物入γ計數(shù)器中測定，行60 s計數(shù)，與未離心時計數(shù)的比為95.0%～96.0%，即為放化純度。

1.2.2 大鼠局灶性腦缺血動物模型的制備 采用大腦中動脈線栓法制作局灶性腦缺血模型[2,3]。大鼠稱重后以10%水合氯醛麻醉后，沿頸前正中部切開皮膚，鈍性分離左側(cè)頸動脈鞘，分離出頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎翼腭、頸外動脈。將4-0單線尼龍魚線自頸總動脈遠(yuǎn)端切口處向頸內(nèi)動脈插入約19～22 mm，阻塞大腦中動脈近端血流。Sham組魚線進入到頸動脈分叉處即可。再灌注時，抽出尼龍繩，使血流再通。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察 取各組大鼠大腦皮質(zhì)病灶處組織(約1 mm×1 mm)，2.5%戊二酸固定4 h，1%鋨酸固定2 h(4℃)，乙醇梯度脫水，Epon 812環(huán)氧樹脂浸透包埋聚合，半薄切片甲苯胺藍(lán)染色固定，超薄(60 nm)切片，鈾鉛雙染，透射電鏡觀察。

1.2.4125I-NGF示蹤 各組大鼠自尾靜脈注入125I-NGF(33 kBq/g)，30 min后處死，用生理鹽水(壓力90～100 cmH2O)行左心室灌注，直至右心耳流出的液體放射性計數(shù)接近0為止。采集大腦組織標(biāo)本后，將其放入含30%蔗糖的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，4℃保存2 d。取左側(cè)大腦皮質(zhì)組織塊，用γ計數(shù)儀計數(shù)，計算100 mg樣品的γ計數(shù)。

1.2.5 腦組織切片放射自顯影 另取固定后的腦組織，浸入制冷劑中，快速冷凍。冷凍后的標(biāo)本不解凍，在恒溫切片機中進行冠狀切片，片厚60 μm，冷凍干燥后，移入室溫暗室中，在安全燈下將標(biāo)本平面向上擺正。裁取和玻片等大的X線片，黑紙包好，放入加干燥劑的塑料袋中，封口，置4℃冰箱中曝光，14 d后在暗室中將X線片取下進行顯影、定影處理，觀察125I-NGF在X線片上的成影部位面積及灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 透射電子顯微鏡觀察

與Sham組比較，缺血2 h組內(nèi)皮細(xì)胞管腔面的微絨毛數(shù)目明顯增多，內(nèi)皮細(xì)胞輕度皺縮，胞質(zhì)中胞飲小泡正在形成，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中部分線粒體輕度腫脹，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突輕度腫脹，細(xì)胞外間隙輕度擴大。缺血2 h再灌注2 h組內(nèi)皮細(xì)胞核明顯皺縮，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體腫脹模糊，基質(zhì)膜增寬，密度變淡，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突腫脹，細(xì)胞外間隙擴大，水腫液積聚(圖1)。

2.2 125I-NGF示蹤

Sham組、缺血1 h組，缺血2 h組、缺血2 h再灌注0.5 h組、缺血2 h再灌注1 h組和缺血2 h再灌注2 h組腦組織125I-NGF的γ計數(shù)分別為(243.2±43.2)、(532.8±171.4)、(705.2±245.2)、(796.4±281.6)、(864.8±291.8)和(1028.2±343.6)cpm/100 mg。與Sham組相比，其余各組大鼠的125I-NGFγ計數(shù)均顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 放射自顯影

Sham組腦室部因BBB不完整有少量的I125-NGF滲入，其他組織未見顯影；缺血2 h組除腦室外部分皮層損傷中心有I125-NGF滲入；缺血2 h再灌注2 h組除腦室外，損傷側(cè)大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下組織均有較多I125-NGF滲入(圖2)。

3 討 論

BBB是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持中樞神經(jīng)功能中具有重要作用。 構(gòu)成BBB的組織是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的緊密連接、基膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足形成的膠質(zhì)膜及極為狹窄的細(xì)胞外膜。緊密連接是保持BBB完整性的重要因素，由跨膜蛋白(claudin、occludin和junctional adlhesion molecule)和膜相關(guān)蛋白(zonula occludens、cingulin、 去唾液酸糖蛋白和7H6)共同組成[3,4]。其結(jié)構(gòu)和功能的破壞將引起B(yǎng)BB通透性增加，甚至發(fā)生腦水腫。其中claudin-5和occludin蛋白是調(diào)節(jié)物質(zhì)通過細(xì)胞緊密連接的最關(guān)鍵成分[5,6]。

本研究利用透射電鏡、放射自顯影技術(shù)和125I-NGF示蹤法，通過建立大鼠局灶性腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)在I/R損傷早期BBB的通透性就發(fā)生了顯著改變，且隨著I/R時間延長，血管周圍間隙增寬、毛細(xì)血管擴張、開放程度增加、透過BBB的125I-NGF增多。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)[7]，I/R 30 min后神經(jīng)元皺縮成扇形，細(xì)胞質(zhì)腫脹，血管周圍水腫，內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹。I/R損傷與BBB結(jié)構(gòu)和功能的繼發(fā)性破壞密切相關(guān)，BBB的屏障功能減弱及通透性增加可引起嚴(yán)重的血管源性腦水腫和其他并發(fā)癥[8]。Rapoport等[6]發(fā)現(xiàn)腦缺血初期，細(xì)胞外液中的谷氨酸可持續(xù)高出正常值的數(shù)十倍，構(gòu)成谷氨酸的毒性環(huán)境。有研究表明[9,10]，在I/R早期腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中claudin-5和occludin分布的連續(xù)性和表達(dá)情況均發(fā)生改變，claudin-5和occludin在缺血1 h后表達(dá)顯著下調(diào)，隨I/R時間延長，下調(diào)更加顯著。同時，缺血1 h后，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)δ蛋白表達(dá)顯著升高，且其上調(diào)的變化趨勢與BBB開放和緊密連接蛋白表達(dá)下降的趨勢基本一致[10-13]。Amantea等[14]發(fā)現(xiàn)腦缺血1 h時，白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)在缺血區(qū)免疫反應(yīng)加強；缺血2 h再灌注2 h時，白細(xì)胞介素1β和TNF在缺血和半暗帶的表達(dá)均明顯增加，參與腦缺血急性期BBB的破壞和腦水腫?；|(zhì)金屬蛋白酶系(matrix metallo proteinase system，MMPs)能降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)，在腦缺血2 h再灌注2 h時，MMPs-2水平增高。本研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血1 h后，125I-NGF進入腦組織的量就有所增加，并一直持續(xù)到再灌注2 h，其變化趨勢與上述炎性因子及調(diào)節(jié)蛋白的變化趨勢相一致。因此我們推測在I/R早期，各種炎性因子參與了BBB的破壞，BBB的屏障結(jié)構(gòu)受到損傷，從而引起B(yǎng)BB開放[15,16]。

2002年美國神經(jīng)疾病和腦卒中研究院在“腦卒中進展的回顧和報道”中提出神經(jīng)血管單元的概念：神經(jīng)血管單元由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管組成，在腦組織發(fā)育的過程中，這3種成分相互調(diào)節(jié)、相互作用。在腦卒中發(fā)生后，這3種成分也互相影響[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NGF不僅在發(fā)育過程中調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活，而且能夠?qū)构劝彼崤d奮毒性作用，促進神經(jīng)元的修復(fù)和軸突再生，調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)等神經(jīng)系統(tǒng)功能。所以外源性NGF通過破壞的BBB后，既可以發(fā)揮其抑制神經(jīng)元凋亡和對抗谷氨酸興奮的毒性作用，又可通過神經(jīng)元的修復(fù)促進BBB功能和結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，抑制血管性腦水腫的進一步加重。

綜上所述，BBB在腦I/R早期已發(fā)生了結(jié)構(gòu)和功能的改變。此時， I125-NGF可以通過破壞了的BBB。這為應(yīng)用NGF早期治療腦I/R損傷提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

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