水飛薊素聯(lián)合ATP對化學藥物性肝損傷作用效果研究

■王 敬鄧 陽王梓卓吳國江*

（1.河北農業(yè)大學生命科學學院，河北保定071000；2.河北農業(yè)大學國土資源學院，河北保定071000）

肝臟是動物機體進行物質和能量代謝的主要場所，外源性化學藥物進入機體后，需經肝生物轉化降解以降低其毒副作用，減少對機體損傷，但若長期或大量服用化學性藥物，勢必造成藥物在肝內沉積并對肝臟造成損傷，致使動物疾病頻發(fā)，進而造成死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經濟損失，同時殘留的化學藥物也會通過食物鏈直接或間接給人類健康帶來的危害，從而引發(fā)諸多的食品安全問題。

三磷酸腺苷（ATP）是體內組織細胞一切生命活動所需能量的直接來源。肝功能受損，肝細胞內三羧酸循環(huán)出現(xiàn)受抑，導致肝內ATP水平下降[1]，進而造成蛋白質等合成受阻，影響機體正常的生命活動，所以對肝損傷機體及時補充ATP在一定程度上可以緩解機體細胞損傷進程，降低死亡率。但ATP只能臨時補充體內缺乏的能量物質，對已損傷肝細胞無法進行修復，所以在補充ATP的同時，還需消除肝損傷因素，及時保護或修復受損肝細胞。大量試驗證實[2]，水飛薊素是護肝活性最高、最有效的物質，具有清除自由基[3]、抑制脂質過氧化[4]、穩(wěn)定肝細胞膜[5]的作用，從而減輕肝細胞損傷[6]、促進肝細胞的修復和再生[7]。

本研究以小鼠為試驗動物，將水飛薊素與ATP按照單方使用劑量聯(lián)用，通過考察ALT、AST、SOD、GSH、TP、ALB等指標，以及切片觀察，探討水飛薊素與ATP聯(lián)用對化學性藥物肝細胞保護及受損細胞修復效果，為養(yǎng)殖業(yè)中經常發(fā)生的肝病防治提供適宜藥物和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物

健康成年清潔級SPF昆明小鼠[(18～22)g]70只，雌、雄各半。由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供（11401500008918）。

1.2 試驗藥品

水飛薊素，購自盤錦德潤生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒、總蛋白（TP）測定試劑盒、白蛋白(ALB)測定試劑盒，均購自中生北控生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；四氯化碳（CCl4）分析純，購自天津市北方化玻購銷中心；三磷酸腺苷購自國藥集團榮生制藥有限公司。

1.3 試驗儀器

電子調溫萬用電爐（型號為DK-98-Ⅱ），購自上海亞榮生化儀器廠。旋轉蒸發(fā)儀（型號為RE-52A），購自上海亞榮生化儀器廠。紫外-可見分光光度計（型號為752型），購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司。普通型離心機（型號為LDZ-52），購自北京離心機廠。數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號為HH-4），購自金壇市華特試驗儀器有限公司。電子天平（型號為JA2103），購自金壇市華特試驗儀器有限公司。電熱恒溫鼓風干燥箱（型號為DHG-9240A），購自上海飛越試驗儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 小白鼠預飼

將70只小白鼠在常溫下，自由飲食7 d，待動物適應后，依試驗分為空白組(Ⅰ組)和受試組(6組)，其中空白組(10只)飼喂蒸餾水(0.2 ml/只)，其余各組(10只/組，共60只)分別均灌胃30%CCl4溶液(0.2 ml/只)，給藥3 d后依據(jù)以血清轉氨酶（AST和ALT）、肝組織指標(SOD和GSH)和病理切片進行分析評價，確定造模成功。

2.2 試驗動物的分組及給藥劑量

試驗造模成功后，將各受試組隨機分為模型對照組（Ⅱ組）、ATP組（Ⅲ組）、水飛薊素組（Ⅳ組）、水飛薊素聯(lián)合ATP低劑量組（Ⅴ組）、水飛薊素聯(lián)合ATP中劑量組（Ⅵ組）、水飛薊素聯(lián)合ATP高劑量組（Ⅶ組）及空白對照組（Ⅰ組），共7組，每組10只小鼠，其中空白對照組（15 ml/kg），ATP組（15 ml/kg，其中ATP 0.6 mg/ml）；水飛薊素組（15 ml/kg，其中水飛薊素2.06 mg/ml）；水飛薊素聯(lián)合ATP低劑量組（15 ml/kg，其中水飛薊素2.06 mg/ml，ATP 0.6 mg/ml）；Ⅵ組水飛薊素聯(lián)合 ATP中劑量組（15 ml/kg，其中水飛薊素4.12 mg/ml，ATP 1.2 mg/ml）；Ⅶ組水飛薊素聯(lián)合ATP高劑量組（15 ml/kg，其中水飛薊素8.24 mg/ml，ATP 2.4 mg/ml），共給藥7 d。試驗結束后，采用摘除眼球方法取血進行試驗研究。

3 水飛薊素聯(lián)合ATP的使用對CCl4所致肝損傷的作用效果研究

3.1 采血

3.1.1 血清的制備

給藥結束后于第8 d采用摘除眼球取血方法，將采到的血于3 500 r/min離心l0 min分離血清，4℃保存待測。

3.1.2 肝勻漿的制備

剪取0.6 g肝組織，加入5.4 ml的生理鹽水充分研磨，立即制成10%的肝勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液備用。

3.2 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細胞修復程度的測定

血清中所檢測的ALT和AST活性的高低反映了細胞的損傷程度，而蛋白質產生的多少則反映出肝臟的功能是否恢復，因此，試驗通過檢測小鼠血清中ALT和AST活性的多少來反映藥物對小鼠肝細胞損傷的修復程度，對ALB和TP的含量的檢測來反映肝臟功能恢復的程度。操作方法按照ALT、AST、ALB和GTP試劑盒的操作步驟進行。

3.3 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細胞損傷保護程度的測定

SOD和GSH為肝臟中的還原性物質，能夠與肝臟中的自由基反應從而保護肝臟細胞免于自由基的損傷。因此，試驗用檢測肝臟中SOD和GSH的活性來觀察藥物對小鼠肝臟的保護作用。操作方法按照SOD和GSH試劑盒的操作步驟進行。

3.4 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝臟結構的影響

用HE染色石蠟切片，采用光學顯微鏡對封固好的切片進行觀察，并連接電腦進行拍照。

3.5 試驗數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件進行方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準差表示。

4 結果

4.1 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細胞修復程度的作用效果（見表1、表2）

表1 小鼠血清中AST、ALT的活性測定結果(x±s)

表2 小鼠血清中ALB、TP含量測定結果（x±s）

由表1可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的AST和ALT的活性極顯著升高（P＜0.01），說明試驗造模成功；與Ⅱ組相比，各試驗組AST和ALT活性極顯著降低（P＜0.01），說明各藥物均對AST和ALT活性的升高有較好的抑制作用；但Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組相比AST和ALT活性的差異極顯著（P＜0.01），Ⅵ組、Ⅶ組的AST和ALT與Ⅰ組相比差異不顯著（P＞0.05），說明Ⅵ組、Ⅶ組的藥物能夠使小鼠的AST和ALT活性降低且接近恢復正常狀態(tài)。

由表2可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組ALB的含量極顯著降低（P＜0.01），TP的含量極顯著升高（P＜0.01），表明CCl4模型試驗成功；與Ⅱ組相比，各試驗組ALB的含量極顯著升高（P＜0.01），TP含量極顯著降低（P＜0.01），說明各藥物均可以使ALB的含量升高，使TP降低。但Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組的ALB和TP含量相比差異極顯著（P＜0.01），Ⅵ組、Ⅶ組與Ⅰ組的ALB和TP含量相比差異不顯著（P＞0.05），說明Ⅵ組、Ⅶ組的藥物能夠使小鼠的ALB含量升高、TP含量降低且接近恢復正常狀態(tài)。

4.2 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細胞損傷保護程度的作用效果（見表3）

由表3可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的SOD和GSH的活性極顯著降低（P＜0.01），說明試驗造模成功；各試驗組與Ⅱ組比較SOD活性和GSH的活性極顯著升高（P＜0.01），說明各藥物組均可以使SOD和GSH的活性升高；但Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組的SOD和GSH活性相比差異極顯著（P＜0.01），Ⅵ組、Ⅶ組與Ⅰ組的SOD和GSH活性相比差異不顯著（P＞0.05）說明Ⅵ組、Ⅶ組的藥物能夠使小鼠的SOD和GSH活性升高且接近恢復正常狀態(tài)。

表3 小鼠血清中SOD、GSH活性測定結果（x±s）

4.3 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝臟結構的影響（見圖1）

圖1 小鼠肝臟病理切片

由圖1可見，正常組小鼠肝索排列正常，放大倍數(shù)可觀察到無炎性細胞浸潤和壞死，模型對照組小鼠，肝索紋理不清晰，高倍鏡下可看到炎性細胞浸潤、肝細胞壞死嚴重，說明試驗造模成功。當給小鼠灌胃水飛薊素聯(lián)用ATP的中、高劑量時可觀察到肝索排列基本正常，高倍鏡下細胞的炎性浸潤減輕，細胞死亡數(shù)明顯減少，與空白組接近。

5 討論

化學藥物性肝損傷在養(yǎng)殖業(yè)中屬于常見的多發(fā)病。發(fā)病初期的動物主要表現(xiàn)為消化不良、食欲不振。若不及時治療則會使動物出現(xiàn)肝炎、肝硬化甚至是死亡[8]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失。目前，對于化學藥物性肝損傷的治療大多數(shù)為西藥制品，然而西藥往往在治療肝病的同時會產生極大的副作用[9]，損傷其他器官，因此，不能從根本上解決化學藥物性肝損傷的問題。試驗摒棄了西藥的弊端，使用傳統(tǒng)的保肝類中藥水飛薊素[10]，并在其基礎上添加ATP，保證了在治療化學藥物性肝損傷時及時為受損的肝細胞進行能量補充，緩解機體細胞損傷[11]。二者聯(lián)用，相輔相成，最終達到解決化學藥物性肝損傷的目的。

化學性藥物對肝損傷因子，主要側重于自由基?；瘜W藥物在酶CYP2E1的作用下產生的自由基即可與蛋白質中的巰基共價結合，導致蛋白質功能發(fā)生障礙[12]，也可與氧結合生成過氧化物使脂質發(fā)生過氧化反應[13]，同時自由基還可破壞細胞膜并直接攻擊線粒體和DNA，影響能量和DNA的合成[14]，導致細胞凋亡和壞死進而引發(fā)整個肝臟功能障礙，使動物出現(xiàn)消化不良、食欲不振等癥狀[15]。Recknagel等[16]通過試驗證實，機體中的還原性物質SOD（超氧化物歧化酶）和GSH（還原型谷胱甘肽）能與自由基結合成結合物，從而降低對肝臟的損傷。因此，在飼料中添加能夠促進機體內還原物質釋放或使受損的細胞恢復產生還原性物質功能的保肝藥物可在一定程度上降低對動物肝臟的損害。

SOD和GSH能夠與自由基反應[17]，從而降低自由基對肝細胞的損傷作用，當二者含量降低時會導致過量的自由基不能夠被清除而引發(fā)脂質過氧化和細胞的壞死。試驗結果顯示，小鼠在灌胃水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量后SOD和GSH的活性升高，且與四氯化碳組比較差異極顯著（P＜0.01），與空白組比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在提高SOD和GSH活性的方面有很好的的作用[18]，能夠在一定程度上緩解由自由基引起的脂質過氧化和細胞的壞死；化學藥物性肝損傷除了引發(fā)自由基，造成肝細胞損傷外，還可造成血清中AST和ALT[19]活性的變化。AST和ALT[19]存在于細胞的胞漿中，當細胞膜受損時，位于胞漿中的AST和ALT外流，導致血清中的AST和ALT的活性升高。因此，檢測血清中AST和ALT活性，可直接反映細胞膜的損傷程度。試驗證實，中、高劑量水飛薊素與ATP聯(lián)用后小鼠血清中AST和ALT的活性降低且與四氯化碳組相比差異極顯著（P＜0.01），與空白組相比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在一定程度上能夠降低細胞膜的損傷，從而抑制胞漿中AST和ALT的外流，使血清中AST和ALT活性降低。

白蛋白(ALB)、總蛋白（TP）只有在肝臟中才能夠合成，其水平的高低是檢測肝損傷的標志性指標之一[20]，若ALB的含量降低，TP的含量升高則會導致急慢肝炎的發(fā)生。試驗結果顯示，小鼠在灌胃水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量藥物后ALB的含量升高，TP的含量降低，且與四氯化碳組相比差異極顯著（P＜0.01），與空白組比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在提高ALB和降低TP的含量的方面有很好的作用，能夠在一定程度上緩解急慢性肝炎的發(fā)生。從試驗切片也能看出，四氯化碳模型對照組，小鼠肝索紋理不清晰，有炎性細胞浸潤、肝細胞組織壞死灶，而灌胃水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量組的小鼠，肝索排列基本正常，細胞炎性浸潤減輕，死亡細胞數(shù)明顯減少，與空白組接近，說明水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量組的藥物對小鼠肝損傷有一定的緩解作用。

試驗證實，聯(lián)合應用水飛薊素和ATP中、高劑量，可以較好緩解化學藥物性肝損傷的問題，使肝臟恢復生產SOD和GSH的能力，降低自由基對肝臟細胞的損傷，使肝臟恢復正常功能，抑制化學藥物性肝損傷的進一步發(fā)展，為養(yǎng)殖業(yè)解決化學性藥物肝損傷提供理論和試驗依據(jù)。