酶解法測定常用飼料原料中淀粉的含量

■ 雷 龍 李 強 馮 志 方 勇 張丹丹 王立偉 任 瑩，3 趙勝軍，3*

（1.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢430023；2.通遼市科爾沁畜牧工作站，內(nèi)蒙古通遼028000；3.動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430023）

淀粉是谷物、籽實和塊根塊莖飼料中的主要組成成分，也是動物營養(yǎng)中重要的供能營養(yǎng)物質(zhì)，淀粉是飼料分析和食品檢測中需要經(jīng)常測定的營養(yǎng)指標(biāo)之一，因此，淀粉的測定方法除了要求測定結(jié)果準(zhǔn)確外，還需要操作簡便和快捷。代立剛等(2013)[1]對測定總淀粉含量的方法進行了分類，介紹了常用方法、標(biāo)準(zhǔn)方法和近幾年發(fā)展的新方法，對各種方法的原理、優(yōu)缺點和適用的類型進行了評論，對人們在選擇總淀粉含量測定的方法時起到一定的參考作用。常用的方法有比色法、酶解法、酸解法和旋光法等。

J.Holm等(1986)[2]提出的快速分析測定淀粉的方法被認(rèn)為是最準(zhǔn)確、最經(jīng)典的測定淀粉的方法，在該方法中樣品先后經(jīng)過熱穩(wěn)定性α-淀粉酶(α-amylase)、淀粉葡萄糖苷酶（amyloglucosidase)和葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)的處理，然后用分光光度計在450 nm下比色測定。該方法具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點，缺點是三種酶制劑在國內(nèi)很難同時購得，而且酶制劑規(guī)格千差萬別，同時由于酶制劑價格昂貴，造成了測定成本會很高，因此限制了該方法的推廣應(yīng)用。張平等(2005)[3]參考Megazyme公司試劑盒提供的方法[Mc?cleary等(1997、1994)[4-5]；Englyst等(1988)[6]]，結(jié)合國內(nèi)實際情況，探討利用酶水解準(zhǔn)確、方便、快捷的測定飼料中總淀粉含量，為飼料行業(yè)測定總淀粉提供一種參考方法。但是由于該試劑盒價格昂貴而沒有得到廣泛推廣。Isabel（1997）[7]將J.Holm等(1986)[2]采用的酶解法進一步優(yōu)化后，使淀粉的測定更加簡便快捷,并且統(tǒng)一采用Sigma公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化酶制劑,使該酶解法得到廣泛應(yīng)用。國標(biāo)中飼料淀粉含量測定方法——旋光法，使用試劑、儀器較少 ，過程簡單，操作簡便，但不適用于含有光學(xué)活性且不溶于體積分?jǐn)?shù)40%乙醇的淀粉以外的物質(zhì)，或是富含葡萄糖或含直鏈淀粉超過40%的產(chǎn)品。酸解法是目前食品工業(yè)中測定淀粉的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，有研究表明，酸解法只適用于測定淀粉含量較低（不超過40%）的飼料飼料[8]。本試驗采用Isabel（1997）[7]提出的酶解法對20余種飼料原料中淀粉含量進行了測定，同時據(jù)實驗室條件用酸解法測定淀粉含量作為驗證。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

收集常用動物飼料樣品20余種，包括能量飼料(玉米、小麥、麩皮、米糠)、蛋白質(zhì)飼料(豆粕、棉粕、菜粕、葵花籽粕、棕櫚仁粕)等，風(fēng)干，過40目篩，裝在廣口瓶中備用。

采用《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》(楊勝，1993)[9]中的方法測定飼料樣品的干物質(zhì)含量。

1.2 試驗步驟

1.2.1 試驗方法

酸解法具體方法按照國標(biāo)GB/T5009.9—2008執(zhí)行[10]，酶解法參照Isabel(1997)[7]的方法。

1.2.2 試驗原理

將淀粉完全分散在強堿溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH值，將淀粉分解成葡萄糖。再通過使用Tris-葡萄糖氧化酶（Tris-Glucose Oxidase,TGO）試劑測定葡萄糖的釋放量。將測定葡萄糖的含量乘以轉(zhuǎn)化因子0.9即得淀粉的含量。

1.2.3 主要試劑及儀器

醋酸鈉(國藥集團，化學(xué)純)、林聯(lián)茴香胺(國藥集團，化學(xué)純)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團，分析純)、苯甲酸(國藥集團，化學(xué)純)、淀粉葡萄糖苷酶(Sigma，10115)、曲拉通(Sigma，N50)、葡萄糖氧化酶(Sigma，G7141)、辣根過氧化物酶(Sigma，P8375)、粉碎機、錐形瓶、振蕩水浴鍋、100 ml容量瓶、渦旋振蕩器、200 μl進樣器、pH計。

1.2.4 試驗步驟

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

① 用無水葡萄糖配制250 μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μl葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 ml離心管中；

②各試管中分別加入蒸餾水，均調(diào)整為200 μl；

③在試管中分別加入TGO（Tris-葡萄糖氧化酶試劑）溶液3 ml，37 ℃水浴60 min。

④取出試管并用冷水沖洗試管終止反應(yīng)，室溫放置15 min，用分光光度計在420 nm波長下用1cm比色杯比色，測定吸光值；

⑤以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出其回歸方程：y=ax+b。式中：y——吸光值；

x——葡萄糖的含量（μg）。

1.2.4.2 試驗樣品的測定

①樣品采集

準(zhǔn)確稱取100 mg混合樣品于100 ml的試管內(nèi)，其中包括四個重復(fù)。

②樣品水解

在試管中加入少量蒸餾水和 2 mol/l NaOH溶液，渦旋振蕩均勻后轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，40℃水浴劇烈振蕩 60 min。用 2 mol/l的HCl溶液、0.1 mol/l的HCl溶液和0.4 mol/l的醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)試管內(nèi)溶液pH值至4.75左右。加蒸餾水定容至100 ml，再取10 ml溶液于錐形瓶中，加入活性單位為200 U的淀粉葡萄糖苷酶。將錐形瓶置于恒溫振蕩器中水浴3 h后，取錐形瓶中10 ml溶液轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中定容。

③樣品測定

取容量瓶中200 μl溶液到試管中，加入3 ml TGO試劑，在37℃水浴60 min。取出試管，用冷水沖洗試管終止反應(yīng)，室溫放置15 min，在420 nm下用蒸餾水調(diào)零，1 cm比色杯比色，測定吸光值。參考所作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算葡萄糖含量，淀粉含量為葡萄糖值乘以0.9。

2 結(jié)果

酶解法和酸解法測定的22種飼料原料淀粉含量結(jié)果見表1。

3 討論

方勇等（2015）[8]研究了飼料纖維水平對淀粉含量測定方法準(zhǔn)確性的影響，結(jié)果表明，在有纖維的條件下，酶解法測定淀粉含量比酸解法和蒽酮比色法更準(zhǔn)確，同時也表明酶解法更適合測定飼料中淀粉的含量。本文主要介紹了一種利用酶水解測定總淀粉含量的方法，并測定了22種常見飼料原料中總淀粉的含量，同時與國標(biāo)(酸解法)測定的淀粉數(shù)據(jù)比較，驗證酶解法測定的準(zhǔn)確性。

從酶解法試驗結(jié)果可以看出玉米、小麥、麩皮和米糠等能量飼料中淀粉含量比較高，介于29.25%～72.13%之間，且酶解法測定結(jié)果趨向高于酸解法的測定結(jié)果，這同蔣雁（2007）[11]研究相同，可能是由于鹽酸水解淀粉不完全所致。豆粕、全脂膨化豆粕、菜粕、棉粕和葵花籽粕等蛋白飼料中淀粉含量普遍偏低，介于9.37%～19.73%。國產(chǎn)和進口DDGS中淀粉含量分別為12.88%和15.66%，棕櫚粕中淀粉的含量較低。通過與酸解法測定結(jié)果比較，表明酶解法測定的飼料原料淀粉含量具參考意義。本文介紹的這種利用酶解法測定總淀粉含量的方法，及測定了22種飼料原料的淀粉值，可以為今后淀粉測定的研究作參考。

表1 常用飼料原料淀粉含量（%）

4 結(jié)論

① 相較于國標(biāo)(酸水解法)，酶解法測定玉米、小麥、麩皮和米糠等能量飼料原料以及菜粕、米糠粕、棉粕等蛋白飼料原料中淀粉含量數(shù)據(jù)更具參考性；

②本文研究的酶解法對葵花籽粕、國產(chǎn)和進口DDGS中淀粉含量的測定具有一定的參考意義。