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    組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸聯(lián)合姜黃素對(duì)MCF—7R乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的影響

    2017-01-06 19:26:48樓亞玲曹恒斌
    關(guān)鍵詞:對(duì)數(shù)抑制率耐藥

    樓亞玲+++曹恒斌

    [摘要] 目的 探討丙戊酸(VPA)聯(lián)合姜黃素(CUR)對(duì)人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7R增殖抑制的影響及其作用機(jī)制。方法 分別用100、10、1、0.1、0.01 μg/mL阿霉素(ADR)作用于MCF-7R細(xì)胞和敏感株細(xì)胞MCF-7細(xì)胞72 h后,MTT法測(cè)定ADR對(duì)各組細(xì)胞的抑制率,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50),判定MCF-7R細(xì)胞的耐藥情況;用20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA、空白對(duì)照及320、160、80、40、20、10、5 μmol/L CUR、空白對(duì)照分別作用于MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h,用MTT法分析細(xì)胞增殖抑制率;將VPA 0.625 mmol/L分別與10、20、40 μmol/L CUR聯(lián)合作用于MCF-7R細(xì)胞 24、48及72 h后,用MTT法分析聯(lián)合用藥細(xì)胞增殖抑制率及Q值;將VPA 0.625 mmol/L與10 μmol/L CUR聯(lián)合作用于MCF-7R細(xì)胞 48 h后,高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。 結(jié)果 MCF-7R與MCF-7細(xì)胞IC50分別為(60.30±20.30)、(5.59±1.87)μg/mL,MCF-7R細(xì)胞耐藥倍數(shù)約為10.8倍。不同濃度VPA或VPA處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h后,結(jié)果提示對(duì)VPA或VPA對(duì)MCF-7R細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度和時(shí)間相關(guān)(P < 0.05);聯(lián)合用藥結(jié)果顯示,在相同作用時(shí)間下,CUR濃度越高,抑制率越高(P < 0.05)。金正均Q值法判斷兩藥聯(lián)用結(jié)果顯示,0.625 mmol/L VPA與10 μmol/L CUR聯(lián)合作用48 h時(shí)兩藥有明確的相加作用(P < 0.05),而其他聯(lián)合用藥及作用時(shí)間表現(xiàn)出兩藥拮抗作用,其中各聯(lián)合用藥組作用48、72 h時(shí)的Q值比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),而作用24 h時(shí)Q值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。單用0.625 mmol/L VPA見(jiàn)少量細(xì)胞減少;10 μmol/L CUR也可導(dǎo)致較多細(xì)胞死亡,兩藥物聯(lián)用時(shí)較單獨(dú)用藥細(xì)胞數(shù)量減少明顯。 結(jié)論 VPA及CUR在低劑量聯(lián)用時(shí)存在相加作用,高劑量聯(lián)用時(shí)兩者呈現(xiàn)拮抗作用。

    [關(guān)鍵詞] 丙戊酸;姜黃素;MCF-7R;增值抑制

    [中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2016)10(a)-0021-04

    Inhibitory effect of HDACi VPA combined with CUR on proliferation of breast cancer MCF-7R cells

    LOU Yaling CAO Hengbin

    Department of Pharmacy, Huzhou Central Hospital, Zhejiang Province, Huzhou 313000, China

    [Abstract] Objective To investigate the proliferation and inhibition of valproic acid (VPA) and curcumin (CUR) on human breast cancer cells (MCF-7R), and the effect of proliferation mechanism on MCF-7R cell. Methods The different concentrations of 100, 10, 1, 0.1, 0.01 μg/mL ADR on MCF-7 and MCF-7R cells after 72 h , the proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay, and inhibitory concentration (IC50) was computed; the different concentrations of 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 mmol/L VPA and blank control, the different concentrations of 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5 μmol/L CUR and blank control on MCF-7R cell after 24, 48 and 72 h, the proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay and the proliferation inhibition rate value was computed; 0.625 mmol/L VPA was combined with 10, 20, 40 μmol/L CUR on MCF-7R cell after 24, 48 and 72 h, the cell proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay and the proliferation inhibition rate value was computed; 0.625 mmol/L VPA and 10 μmol/L CUR on MCF-7R cell after 48 h, the changes of cells number and morphology were observed. Results IC50 of MCF-7R and MCF-7 cell was (60.30±20.30), (5.59±1.87) μg/mL, respectively, the resistant factor of MCF-7R cell was about 10.8. The effect of different concentrations of VPA and CUR on MCF-7R cell after 24, 48 and 72 h was depended on the concentrations and time (P < 0.05); the combined effect showed that, the higher concentrations of CUR, the bigger IR-values on the same time (P < 0.05). The Jin zheng-jun Q-value method showed that, only 0.625 mmol/L VPA combined with 10 μmol/L CUR had additive effection (P < 0.05), other combination groups and dealt time had antagonistic effection (P < 0.05), and the Q-value of each combination group after 48, 72 h had statistically significant difference (P < 0.01), while the 24 h group did not have significant difference (P > 0.05); the reducing of the number of cells in 0.625 mmol/L VPA treatment group was not obvious, many apoptosis was leaded by 10 μmol/L CUR, and the combination of VPA 0.625 mmol/L and CUR 10 μmol/l decreased more than the monotherapy group. Conclusion VPA combined with CUR has synergistic effect on low dosage, but has antagonistic effect on high dosage.

    [Key words] Valproic acid; Curcumin; MCF-7R; Inhibitory effect

    乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升,20世紀(jì)末的統(tǒng)計(jì)資料表明,全世界每年約有130萬(wàn)人被診斷為乳腺癌,在我國(guó),乳腺癌在城市的發(fā)病率為女性腫瘤的第二位,在農(nóng)村為第五位[1]?;熌退幒娃D(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是乳腺癌難以根治的主要原因,化療有效率僅為40%~80%[2]?,F(xiàn)研究認(rèn)為,丙戊酸(VPA)和姜黃素(CUR)對(duì)人類腫瘤細(xì)胞均存在較強(qiáng)的抗腫瘤活性,且毒副作用小[3-6],將它們應(yīng)用于臨床治療腫瘤及改善腫瘤耐藥問(wèn)題均表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本研究主要采用VPA聯(lián)合CUR作用于MCF-7R和MCF-7細(xì)胞,在體外評(píng)價(jià)兩藥合用效果并探討其合用的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    VPA(Sigma公司);阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):130707);CUR(Alddin公司,批號(hào):C1213019);四氮唑藍(lán)、胎牛血清及DMSO(Amresco公司);MEM、DMEM、青霉素/鏈霉素及胰蛋白酶(Gibco公司);人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7R和人乳腺癌敏感株MCF-7(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7R(MCF-7)細(xì)胞由含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL),鏈霉素(100 U/mL)培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng),于37℃(5%CO2,95%空氣),飽和濕度,待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%左右融合,用0.25%胰蛋白酶液消化后進(jìn)行傳代。MCF-7R耐藥細(xì)胞除上述條件外,需加入1.0 μg/mL的阿霉素,以維持細(xì)胞的耐藥性,實(shí)驗(yàn)前2周停藥。CUR由二甲基亞砜(DMSO)稀釋為100 mmol/L母液,分裝,避光-20℃冰箱保存,2周內(nèi)有效,使用前以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度,使DMSO終濃度<0.1%;VPA由PBS液稀釋為1 mol/L母液,0.22 μm針式濾器過(guò)濾除菌,分裝,-20℃冰箱保存,使用前以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

    1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)(MTT) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7R及MCF-7細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,棄去上清培養(yǎng)液,用含10%FBS的MEM及DMEM培養(yǎng)液重懸并打勻后,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將細(xì)胞液稀釋至5×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,37℃、5%CO2過(guò)夜貼壁培養(yǎng)24 h后,分別加入不同濃度的ADR溶液,使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL,藥物作用72 h后,每孔加入20 mL MTT溶液(2.5 mg/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4~6 h后,吸棄細(xì)胞上清液,每孔加入100 mL DMSO,輕微振蕩,待甲瓚完全溶解后用自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度值(OD值)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7R細(xì)胞按上述方法處理,37℃、5%CO2過(guò)夜貼壁培養(yǎng)24 h后,分別加入不同濃度的VPA溶液,使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L,24、48、72 h后得到相應(yīng)濃度及時(shí)間下的增殖抑制率,并根據(jù)這個(gè)結(jié)果選擇后續(xù)試驗(yàn)VPA濃度;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7R細(xì)胞,按上述方法處理,加入不同濃度的CUR溶液,使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為320、160、80、40、20、10、5 μmol/L,24、48、72 h后得到相應(yīng)濃度及各時(shí)間下的增殖抑制率及各時(shí)間段的半數(shù)抑制濃度,根據(jù)結(jié)果選擇后續(xù)試驗(yàn)濃度,每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照,分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,細(xì)胞增殖的抑制率(IR%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%。

    1.2.3 合并用藥效果評(píng)價(jià) 評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制是否有協(xié)同作用,參照金正均Q值法判斷:Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb),其中Ea+b為合并用藥的抑制率,Ea和Eb分別為A藥和B藥單獨(dú)用藥的抑制率。Q<0.85為拮抗,0.85≤Q<1.15為相加,Q≥1.15為協(xié)同[7]。

    1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7R細(xì)胞,以5×104/孔接種于96孔板,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后,加入終濃度為0.625 mmol/L VPA、10 μmol/L CUR、0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR與聯(lián)合處理48 h后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn);IC50用Probit回歸法計(jì)算,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ADR對(duì)MCF-7R/MCF-7細(xì)胞增殖的影響

    用100、10、1、0.1、0.01 μg/mL ADR處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7R細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞72 h,根據(jù)OD值計(jì)算抑制率,用Probit回歸法計(jì)算IC50。阿霉素對(duì)MCF-7R細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞作用的IC50分別是(60.30±20.30)、(5.59±1.87)μg/mL,MCF-7R耐藥倍數(shù)約為10.8倍。

    2.2 VPA對(duì)MCF-7R細(xì)胞的增殖抑制作用

    20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA及空白對(duì)照處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h,根據(jù)OD值計(jì)算抑制率,提示各組VPA對(duì)MCF-7R細(xì)胞抑制作用與濃度和時(shí)間相關(guān)(P < 0.01),見(jiàn)表1。因VPA在臨床治療應(yīng)用中濃度監(jiān)測(cè)安全范圍為50~100 μg/mL,盡量減少藥物細(xì)胞毒性作用對(duì)結(jié)果的影響,該實(shí)驗(yàn)VPA濃度應(yīng)選為0.625 mmol/L[8]。

    2.3 CUR對(duì)MCF-7R細(xì)胞的增殖抑制作用

    320、160、80、40、20、10、5 μmol/L CUR及空白對(duì)照處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h后,根據(jù)OD值計(jì)算抑制率。結(jié)果,CUR對(duì)MCF-7R細(xì)胞抑制作用與濃度和時(shí)間相關(guān)(P < 0.01),見(jiàn)表2。Probit回歸法計(jì)算CUR 24、48及72 h IC50,分別為23.7、49.8和38.6 μmol/L,該實(shí)驗(yàn)CUR后續(xù)濃度為10、20、40 μmol/L。

    2.4 VPA聯(lián)合CUR對(duì)MCF-7R細(xì)胞增殖的影響

    0.625 mmol/L VPA分別作用于40、20、10 μmol/L CUR處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h后,根據(jù)OD值計(jì)算抑制率。結(jié)果顯示,在相同作用時(shí)間下,抑制率的高低取決于CUR的濃度,CUR濃度越高,抑制率越大(P < 0.01)。

    2.5 金正均Q值法判斷兩藥聯(lián)用效果

    采用金正均Q值公式計(jì)算Q值,分析VPA聯(lián)合CUR對(duì)MCF-7R細(xì)胞增殖抑制率的增強(qiáng)是否具有協(xié)同作用。Q<0.85為拮抗,0.85≤Q<1.15為相加,Q≥1.15為協(xié)同。結(jié)果顯示,當(dāng)CUR為10 μmol/L作用48 h時(shí),兩藥物聯(lián)合有明確相加作用(P < 0.01);而各聯(lián)合用藥組作用24、72 h時(shí)及20、40 μmol/L CUR聯(lián)合0.625 mmol/L VPA作用48 h時(shí)均表現(xiàn)出拮抗作用。各聯(lián)合用藥組作用48、72 h時(shí)Q值比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),作用24 h時(shí)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。

    2.6 聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的影響

    空白組與單獨(dú)使用0.625 mmol/L VPA組48 h后細(xì)胞增殖狀態(tài)良好,數(shù)目形態(tài)未見(jiàn)明顯變化;單獨(dú)使用10 μmol/L CUR組數(shù)目稍有減少,0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR處理組,數(shù)目形態(tài)發(fā)生較為明顯改變,可見(jiàn)少量細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,體積變小,大小不等,培養(yǎng)基中可見(jiàn)少許的細(xì)胞碎片及死亡細(xì)胞。

    3 討論

    VPA是廣譜組蛋白去乙?;敢种苿?,可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和分化,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖等途徑達(dá)到較強(qiáng)抗腫瘤活性[3-6]。VPA可增強(qiáng)多種抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的療效,例如VPA增強(qiáng)順鉑對(duì)小細(xì)胞肺癌的作用,其機(jī)制是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,VPA抑制組蛋白去乙?;?的表達(dá),上調(diào)P21,并抑制Bcl-xL的表達(dá),從而增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用[9]。另外VPA聯(lián)合RAS抑制劑抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖,因阻礙Survivin與Aurora A的表達(dá)[10]。

    CUR具有一定的抗腫瘤作用,能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)分化、誘導(dǎo)凋亡等作用[4,11]。CUR可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào),CUR可通過(guò)作用不同分子靶點(diǎn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的抑制,例如上調(diào)cdk抑制劑、P53,下調(diào)CyclinD1、cdk-1、cdk-2、NF-kB[12],并可增強(qiáng)順鉑或奧沙利鉑抗腫瘤作用,并能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[13-15],且與下調(diào)P-gp蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP-1等蛋白表達(dá)有關(guān)[16-17]。CUR的多效活性取決于其復(fù)雜的化學(xué)組成,故其可作用于多條信號(hào)途徑,包括NF-kB、Akt、生長(zhǎng)因子、依賴于Nrf2細(xì)胞保護(hù)途徑、轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)途徑等[18]。

    Fortunati等[19]將適合人體濃度的VPA作用于MCF-7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)P21表達(dá),使細(xì)胞周期停滯于G1期,下調(diào)Bcl-2及上調(diào)Bak表達(dá),從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。另有文獻(xiàn)報(bào)道VPA與CUR聯(lián)合作用于人白血病細(xì)胞,通過(guò)作用于組蛋白乙?;?,導(dǎo)致白血病細(xì)胞的凋亡[20],然而目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道VPA和CUR聯(lián)合作用于乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7R。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的VPA及CUR作用于MCF-7R細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間與濃度依賴性,兩藥聯(lián)用時(shí)0.625 mmol/L VPA+40 μmol/L CUR組各時(shí)間點(diǎn)抑制率均為最高,但在此濃度下兩藥并未呈示相加或協(xié)同作用。只有0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR作用48 h時(shí)提示存在相加作用(P < 0.05),其余各組均呈拮抗作用,但作用24 h各組抑制率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。從對(duì)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的影響發(fā)現(xiàn),聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量比單藥作用減少明顯,但不顯著。兩藥在低劑量聯(lián)用時(shí)存在相加作用,高劑量聯(lián)用時(shí)呈拮抗作用,推測(cè)兩藥存在同一作用靶點(diǎn)或通路,尚待進(jìn)一步深入研究。

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    (收稿日期:2016-06-03 本文編輯:任 念)

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