川芎嗪聯(lián)合丹皮酚對CCl4致大鼠肝纖維化的抑制作用及其機制研究

孔德松，張自力，張 峰，邱 萍，鄭仕中

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210001；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3. 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；4. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

川芎嗪聯(lián)合丹皮酚對CCl4致大鼠肝纖維化的抑制作用及其機制研究

孔德松1，張自力2,3，張 峰2,3，邱 萍4，鄭仕中2,3

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210001；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3. 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；4. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

川芎嗪;丹皮酚;肝纖維化;炎癥;凋亡;細胞外基質(zhì)

肝臟是人體內(nèi)最大、最重要的消化及代謝器官，肝病則是世界范圍內(nèi)的一種重要且難治的疾病。全世界約有3億多人感染乙型肝炎病毒，1.7億多人感染丙型肝炎病毒，以及眾多因酒精、化學(xué)物質(zhì)、遺傳及代謝性疾病等原因?qū)е碌钠渌愋透闻K疾病的人群[1-2]。持續(xù)性的肝臟損傷，可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的產(chǎn)生[2]。中國是一個肝病大國，各種慢性肝病嚴重危害人類的健康和生命，深入闡明各類肝病發(fā)病機制，并尋求有效治療策略已刻不容緩。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為通過減少膠原纖維的生成和增強其降解，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，肝硬化的逆轉(zhuǎn)也是可能的[3]。然而，目前療效確切、副作用少的抗纖維化西藥、化學(xué)藥物很少，大多還處在實驗研究階段。由于西藥抗肝纖維化治療的種種限制，國內(nèi)發(fā)揮中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢，遵循“方從法立，以法統(tǒng)方”的原則，進行抗肝纖維化研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在抗肝纖維化治療中具有獨特的優(yōu)勢，如丹參、三七、姜黃、桃仁及其提取物、衍生物和一些在中醫(yī)理論指導(dǎo)下組成的復(fù)方制劑，如復(fù)方861、復(fù)方鱉甲軟肝方等在實驗研究中證實具有明顯抗肝纖維化作用[4-7]?？v觀近十年來運用中藥復(fù)方抗肝纖維化的治法，研究已從過去單純活血化瘀法發(fā)展到扶正化痕、健脾軟肝、清熱利濕、滋養(yǎng)肝腎等多種治法的研究，從而發(fā)揮了中醫(yī)的辨證論治特色，研究水平不斷深人[7-8]。由于肝纖維化的形成和發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，其病理因素呈現(xiàn)多元化，且相兼為患，其治療也非一法一方一藥能解決。因此，發(fā)揚中醫(yī)辨證論治的優(yōu)勢所在，擬定各個階段的基本治則，治療上采取多種治法，并有所兼顧，才能提高臨床療效。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)川芎嗪(ligustrazine, TMP)具有確切的預(yù)防和治療纖維化的作用，川芎嗪能夠抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖活化、遷移、運動，分子機制研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠下調(diào)HSC中PDGF/MAPK、PI3K/Akt通路的蛋白與基因表達[9-10]。同時，研究發(fā)現(xiàn)其可以改善CCl4所致的大鼠纖維化的病理學(xué)改變；明顯降低纖維化時異常升高的ALT、AST、HA、LN、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)；降低血清細胞因子NO、TGF-β1、MMP-2和TNF-α水平[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪聯(lián)合促肝細胞生長素能夠明顯降低血清肝纖維化指標(biāo)(P<0.01)，有較好的抗肝纖維化和改善肝功能作用[12]。我們在研究丹皮酚(paeonol)抗肝纖維化效應(yīng)的實驗中發(fā)現(xiàn)，丹皮酚同樣能夠改善CCl4所致的大鼠纖維化的病理學(xué)改變，減少細胞外基質(zhì)成分的形成，抑制炎癥指標(biāo)NF-κB、TNF-α等的表達，降低肝內(nèi)炎癥水平[13]。

綜合考慮到肝纖維化形成與發(fā)展的復(fù)雜性，以及中藥有效成分所表現(xiàn)出的良好的抗肝纖維化活性，再加上臨床有效化學(xué)藥物的缺失，我們提出聯(lián)合應(yīng)用中藥活性成分進行抗肝纖維化治療的方案。本研究應(yīng)用前期證實有確切抗肝纖維化效應(yīng)的川芎嗪與丹皮酚進行相關(guān)實驗研究。重點闡釋二者聯(lián)合應(yīng)用是否在抑制肝內(nèi)膠原生成與降低炎癥水平等方面具有協(xié)同抗肝纖維化的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級♂SD大鼠，體質(zhì)量200 g～300 g，南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。HSC-T6細胞(中科院上海細胞庫)，川芎嗪(分子質(zhì)量：136.20，無色針狀結(jié)晶)、丹皮酚(分子質(zhì)量：166.18，白色針狀結(jié)晶)購自南京澤朗醫(yī)藥有限責(zé)任公司，ALT、AST、ALP及羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，α-SMA、Fibronectin、Procollagen、TNF-α、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin 抗體(均購自Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time-PCR用試劑(Bio-Rad公司)。

1.2 分組及造模 動物隨機分為5組，每組10只，空白對照組、模型組、川芎嗪組(100 mg·kg-1)、丹皮酚組(100 mg·kg-1)以及聯(lián)合用藥組(川芎嗪100 mg·kg-1+丹皮酚100 mg·kg-1)。除空白對照組外，其余各組采用CCl4油溶液造模，按體質(zhì)量給藥，5 mL·kg-1，腹腔注射，3次/周。實驗期間動物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫，環(huán)境安靜，動物自由進食、進水。造模2周后，從第3周開始灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水。8周后取血制備血清做生化檢查，取肝臟制備病理切片和10%組織勻漿備用。

細胞實驗：取對數(shù)生長期HSC-T6細胞，分為模型組(HSC-T6培養(yǎng)后自動活化)、川芎嗪組(20 μmol·L-1)、丹皮酚組(25 μmol·L-1)、聯(lián)合用藥組(川芎嗪20 μmol·L-1+丹皮酚25 μmol·L-1)，干預(yù)處理24 h。

1.3 組織病理學(xué)觀察 肝臟組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5 μm，常規(guī)HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變，Masson染色及天狼星紅(Sirius red)染色后，觀察各組肝組織中膠原纖維沉積情況，采用國際通用的ISHAK肝臟組織活檢病理學(xué)評分和纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)，對所有標(biāo)本進行炎癥反應(yīng)評分和纖維化分期的病理學(xué)診斷。

1.4 血清ALT、AST、ALP、羥脯氨酸含量測定 全自動生化分析儀測定各組血清中ALT、AST、ALP、羥脯氨酸含量。

1.5 Western blot檢測肝組織中纖維化標(biāo)志蛋白及HSC中炎癥及凋亡相關(guān)通路蛋白的表達 稱取肝臟50 mg，按質(zhì)量/體積比1 ∶5加入預(yù)冷RIPA裂解液，立即加入PMSF和磷酸酶抑制劑，冰上孵育30 min，移入離心管4℃、15 000 r·min-1離心15 min，取上清液為細胞裂解液。HSC用冰冷的 RIPA 裂解緩沖液裂解，收集細胞裂解物，-20 ℃儲藏過夜。BCA法測定蛋白濃度，其余加等體積的6×電泳加樣緩沖液，沸水浴10 min。實驗前4 500 r·min-1離心10min，配制SDS-PAGE凝膠進行上樣(上樣量50 μg)，電泳40 mA 1.5 h，轉(zhuǎn)膜100 V/1.5 h。脫脂奶粉封閉，一抗及二抗孵育，化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

2.1 動物一般情況 空白對照組大鼠實驗期間皮毛光滑，活動正常。模型組和各給藥組造模后見皮毛蓬亂，精神萎靡，行動遲緩，易激惹，個別具有攻擊性。給藥組較模型組毛發(fā)光澤度較好，活動增加明顯，體重均高于模型組。

2.2 肝臟組織病理學(xué)改變 Fig 1結(jié)果顯示，正常組肝臟肝細胞索排列較整齊,未見纖維結(jié)締組織增生及假小葉形成，無變性、壞死，無炎細胞浸潤，匯管區(qū)未見纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細胞索排列紊亂, 有炎癥細胞浸潤，肝細胞水腫，大量纖維組織增生，部分可見假小葉形成。川芎嗪組與丹皮酚組大鼠肝細胞變性壞死明顯減輕，結(jié)締組織明顯減少，偶見假小葉形成，可見炎癥細胞浸潤，肝細胞水腫減輕。聯(lián)合用藥組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞排列尚整齊，中央靜脈周圍可見部分肝細胞變性，纖維組織異常增生不明顯。

2.3 藥物對肝纖維化大鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響 如 Fig 2所示，造模后大鼠血清ALT、AST、ALP和羥脯氨酸水平明顯高于正常對照組(P<0.01)。與模型組比較，川芎嗪和丹皮酚組ALT、AST、ALP和羥脯氨酸水平明顯降低(P<0.05)，聯(lián)合用藥組的效果更加明顯(P<0.01)，聯(lián)合用藥組與川芎嗪或丹皮酚組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 HE(×200) , Masson(×100) and Sirius red (×100) staining of liver tissue in control, model, paeonol or/and TMP treatment group

Fig 2 Effects of paeonol or/and TMP on serum ALT, AST, ALP and hydroxyproline activities

Supplement with paeonol or/and TMP for 32 d significantly inhibited the enhancement of serum ALT, AST, ALP and hydroxyproline activities, respectively.##P<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vspaeonol or TMP.

2.4 藥物對肝纖維化標(biāo)志物及ECM主要成分表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 3)，模型組大鼠肝組織內(nèi)高表達HSC活化標(biāo)志物α-SMA以及ECM主要成分Fibronectin、Procollagen；丹皮酚、川芎嗪干預(yù)組的肝組織內(nèi)這3種成分的表達明顯降低；而兩者聯(lián)合用藥組3種成分的表達量要明顯低于單獨干預(yù)組，聯(lián)合用藥組與丹皮酚或川芎嗪干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 Paeonol or/and TMP inhibits expression of ECM related protein in liver tissue

Western blot analyses of α-SMA, fibronectin and procollagen. β-actin was used as an invariant control for equal loading.

2.5 藥物對HSC炎癥及細胞凋亡相關(guān)通路蛋白表達的影響 模型組TNF-α、NF-κB p65有較強的表達，各治療組 TNF-α、NF-κB p65 表達較模型組有所降低，各組水平依次為：模型組>丹皮酚組或川芎嗪組>聯(lián)合用藥組，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)，HSC中Bax與caspase-3蛋白表達在模型組、丹皮酚治療組或川芎嗪治療組、聯(lián)合用藥組依次升高， Bcl-2蛋白表達則呈現(xiàn)出相反的趨勢。在基因水平，各組NF-κB p65與caspase-3的mRNA表達與蛋白表達情況相同(Fig 4)。

3 討論

肝纖維化是指由于肝損傷誘因的持續(xù)存在，導(dǎo)致肝細胞持續(xù)壞死，繼發(fā)肝臟炎癥或損傷修復(fù)過程中持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維性結(jié)締組織異常增生，細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過量沉積為特征的病理變化[1-2]。因此，理論上如果能通過各種途徑消除致病因素和刺激因子，抑制各種炎癥反應(yīng)和肝細胞外基質(zhì)沉積，促進其降解則有望逆轉(zhuǎn)或阻止肝纖維化的發(fā)生和進展，最終阻止肝硬化的發(fā)生。

A:Western blot analyses of TNF-α, NF-κB p65, Bax, caspase-3, Bcl-2. β-actin was used as an invariant control for equal loading. B: Real time-PCR analyses of NF-κB and caspase-3，GAPDH was used as an invariant control for equal loading.*P<0.05,**P<0.01vsmodel；△P<0.05,△△P<0.01vspaeonol or TMP.

本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪、丹皮酚均具有明顯抗肝纖維化作用，抑制細胞外基質(zhì)的生成與沉積，兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更加明顯，與兩者單獨應(yīng)用相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，為臨床抗肝纖維化提供了新的治療策略。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α/NF-κB 在肝損傷發(fā)病機制中起重要作用，它在肝臟中高表達與繼發(fā)引起的下游調(diào)控基因激活共同參與了肝損傷的發(fā)生和發(fā)展。本實驗對川芎嗪聯(lián)合丹皮酚抗肝纖維化的機制進行了觀察，川芎嗪、丹皮酚可改善肝功能、肝組織纖維化及炎癥壞死程度，具有延緩或阻止肝纖維化的作用。 川芎嗪聯(lián)合丹皮酚較單用兩藥的大鼠肝纖維化程度輕，效果明顯，其機制可能與這些藥物從基因和蛋白水平抑制了TNF-α/NF-κB通路的活性，進而促進了HSC中Bax與caspase-3蛋白表達，抑制了Bcl-2的表達，恢復(fù)了Bcl-2與Bax的比例，從而促進了HSC的凋亡，減輕了肝纖維化程度。

本研究仍存在諸多不足，將在后續(xù)研究中進一步解決：①項目的機制研究還有待于進一步深入，川芎嗪、丹皮酚具體作用靶點在哪里，兩者是如何協(xié)同等；②需要篩選出合適的川芎嗪和丹皮酚的配伍方案，有必要進一步進行相關(guān)配比處方優(yōu)化的研究，以進一步提高藥物組合的抗肝纖維化效應(yīng)。

(致謝: 本文實驗在南京中醫(yī)藥大學(xué)“江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室”完成，感謝實驗室對本項目實驗的鼎力支持! )

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-12-5 15:14 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.042.html

The inhibitory effect of ligustrazine combined with paeonol on rat liver fibrosis induced by CCl4and mechanisms

KONG De-song1, ZHANG Zi-li2, 3, ZHANG Feng2, 3, QIU Ping4, ZHENG Shi-zhong2,3

(1.theThirdAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210001,China; 2.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 3.JiangsuKeyLaboratoryforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 4.ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Aim To explore the inhibitory effect of ligustrazine combined with paeonol on rat liver fibrosis induced by CCl4and its mechanisms, so as to provide new treatment strategies for liver fibrosis in clinical. Methods Cleaning laboratory male SD rats were randomly divided into blank control group, model group (CCl4), ligustrazine group, paeonol group and combination group (ligustrazine+paeonol). HE staining was used to observe the pathological change. Masson staining and Sirius red staining was used to observe the collagen deposition. The levels of serum ALT, AST, ALP and hydroxyproline were detected by automatic biochemistry analyzer. Western blot detected the markers of liver fibrosis. HSC-T6 cell was divided into model group, ligustrazine group, paeonol group and combination group. The protein and gene expression of inflammation and apoptosis pathway was analyzed by Western blot and real time-PCR. Results Ligustrazine combined with paeonol could significantly improve liver tissue pathology changes caused by CCl4. It could reduce serum ALT, AST, ALP and hydroxyproline levels. Moreover, it could also inhibit liver fibrosis marker protein expression, and thus reduce the deposition of collagen fibers. The effect was better than that in single intervention group. Combination group could inhibit the inflammatory pathways related protein expression in HSC cells and promote the apoptosis of HSC cells. Conclusion Ligustrazine in combination with paeonol has significant anti-fibrosis effect, and the effect is better than both single intervention. The effect may be due to the interference with TNF-α/NF-κB pathway in the HSC cells, which promotes its apoptosis and inhibits the generation of extracellular matrix.

ligustrazine; paeonol; liver fibrosis; inflammation; apoptosis; extracellular matrix

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.040.html

2016-07-08，

2016-09-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81270514，31401210，31571455，81600483);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(No ysxk-2010);江蘇省自然科學(xué)基金青年基金資助項目(No BK20140955); 江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目(No 14KJB310011);南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金項目(No YKK14143)

孔德松(1989-)，男，碩士，研究方向：天然藥物預(yù)防和治療肝纖維化與腫瘤，Tel：025-52276505，E-mail：kongds0675@126.com; 鄭仕中(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物預(yù)防和治療肝纖維化與腫瘤,通訊作者，Tel:025-85811246，E-mail:nytws@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.020

A

1001-1978(2016)12-1741-06

R-332；R284.1；R329.25；R364.5； R575.202.2摘要：目的 探索川芎嗪聯(lián)合丹皮酚對CCl4致大鼠肝纖維化的抑制作用及其機制，為臨床肝纖維化提供新的治療策略。方法 清潔級♂ SD大鼠，隨機分為空白對照組、模型組(CCl4)、川芎嗪組、丹皮酚組以及聯(lián)合用藥組(川芎嗪+丹皮酚)。HE染色觀察病理組織學(xué)改變，Masson染色及天狼星紅染色觀察膠原沉積情況，全自動生化儀檢測血清中ALT、AST、ALP和羥脯氨酸，Western blot檢測肝纖維化標(biāo)志物。HSC-T6細胞分為模型組、川芎嗪組、丹皮酚組以及聯(lián)合用藥組，Western blot與Real time-PCR檢測炎癥及凋亡蛋白與基因的表達情況。結(jié)果 川芎嗪與丹皮酚聯(lián)合應(yīng)用能明顯改善CCl4所致肝組織病理改變，降低血清ALT、AST、ALP及羥脯氨酸水平，抑制肝纖維化標(biāo)志蛋白表達，進而減少膠原纖維的沉積，效果明顯優(yōu)于單獨干預(yù)組。聯(lián)合用藥組能抑制HSC中炎癥通路相關(guān)蛋白表達，促進HSC的凋亡。結(jié)論 川芎嗪與丹皮酚聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的抗肝纖維化效應(yīng)，且效果優(yōu)于兩者單獨干預(yù)，這種效果可能是由于干擾了HSC中TNF-α/NF-κB通路，進而促進細胞凋亡，抑制了細胞外基質(zhì)的生成。