水溶性紫杉醇前藥的制備及抗腫瘤活性的研究

趙素華, 楊秀勤, 朱 偉, 鄭朋成，汪晉京， 單玲玲

(1. 宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)系,安徽 宿州 234000; 2. 宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所,安徽 宿州 234000)

水溶性紫杉醇前藥的制備及抗腫瘤活性的研究

趙素華1, 楊秀勤2, 朱 偉2, 鄭朋成2，汪晉京2， 單玲玲2

(1. 宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)系,安徽 宿州 234000; 2. 宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所,安徽 宿州 234000)

目的 紫杉醇是具有良好抗腫瘤療效的化學(xué)藥物，由于紫杉醇本身化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難溶于水，在一定程度上限制了紫杉醇藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此改善紫杉醇水溶性是解決紫杉醇藥物不足的關(guān)鍵問題。方法 本實(shí)驗(yàn)選用水溶性葉酸配體作為“導(dǎo)向基團(tuán)”，谷氨酸為連接葉酸和紫杉醇的Linker，氨基PEG(MW:350)為藥物增溶劑和穩(wěn)定劑，制備水溶性葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥。用LC-MS鑒定前藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過對前藥溶解性及釋藥動力學(xué)曲線的測定，確定前藥的理化性質(zhì)。用MTT實(shí)驗(yàn)分析并對比紫杉醇原藥與前藥在不同腫瘤細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231、A549)和正常細(xì)胞HELF(人胚肺成纖維細(xì)胞)中的毒性和藥效作用。用熒光標(biāo)記法直觀觀察紫杉醇前藥在腫瘤細(xì)胞和組織中的靶向性。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明已成功合成葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥，并具有較好的溶解性和原藥釋放動力學(xué)曲線，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明在葉酸受體-配體作用的介導(dǎo)下，葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥靶向葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，減少對葉酸受體低表達(dá)正常細(xì)胞的毒副作用。結(jié)論 葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥具有良好的抗腫瘤活性。

葉酸;紫杉醇前藥;水溶性; MTT實(shí)驗(yàn);腫瘤細(xì)胞；靶向性

紫杉醇(PTX)是治療多種惡性腫瘤的臨床一線藥物。由于紫杉醇存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難溶于水、靶向性差和毒副作用大等缺點(diǎn)，限制了紫杉醇藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用[1]。目前，國內(nèi)外許多研究者針對紫杉醇藥物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計出多種以大分子如白蛋白、脂質(zhì)體、高分子聚合物等作為紫杉醇藥物載體的藥物傳遞系統(tǒng)，即前藥。研究表明，這些前藥能有效地提高紫杉醇的藥效，減少紫杉醇藥物的毒副作用，但仍存在藥物載藥量低、穩(wěn)定性差、靶向性差等不足，因此還需開發(fā)新型靶向腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng)[2-3]。腫瘤靶向性前藥具有將藥物選擇性地釋放于目標(biāo)部位，降低對正常組織的毒副作用，以及提高藥物療效等明顯優(yōu)點(diǎn)，已成為抗腫瘤藥物研究發(fā)展的主要方向[4]。

在各種腫瘤主動靶向性藥物研究中，以葉酸配體(folate ligand, FA)作為“導(dǎo)向基團(tuán)”所介導(dǎo)的靶向性藥物研究最為成功。葉酸受體(folate recepotor, FR)在正常細(xì)胞/組織中的表達(dá)高度保守，但大多數(shù)惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌等細(xì)胞FR卻高度表達(dá)，比正常細(xì)胞/組織高出100～300倍[5-6]。因此，葉酸配體是設(shè)計靶向藥物傳遞系統(tǒng)的最佳選擇。聚乙二醇化(PEG化)是藥物改造常用的新工藝，不僅可改善難溶藥物的水溶性，同時還可延長藥物在體內(nèi)的代謝時間，從而減少藥物劑量[7]。Linker作為藥物改造中的一種偶聯(lián)中間體，不僅改善藥物的特性，如水溶性、活性及靶向性，而且可以連接藥物與載體。這類Linker主要是通過酯鍵、酰胺鍵或是離子鍵來連接兩端物質(zhì)，在體內(nèi)這些酯鍵、酰胺鍵或是離子鍵易斷裂，使Linker水解,從而釋放出原藥發(fā)揮藥效[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用水溶性較好的葉酸配體作為紫杉醇前藥的“導(dǎo)向基團(tuán)”，氨基PEG化作為紫杉醇前藥的增溶劑和穩(wěn)定劑，谷氨酸作為Linker連接葉酸與紫杉醇，制備葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥(FA-PEG-Glu-PTX)。用LC-MS對靶向性前藥進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，通過對前藥水溶性和釋藥動力學(xué)的測定，確定紫杉醇前藥的理化性質(zhì)，檢測正常細(xì)胞和3種腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體蛋白表達(dá)量，用熒光染料FITC標(biāo)記紫杉醇前藥，通過倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀研究紫杉醇前藥的靶向性，用MTT實(shí)驗(yàn)分析與對比腫瘤靶向性前藥對不同細(xì)胞的靶向性和藥效。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動物 人肺癌細(xì)胞株(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7、MDA-MB-231)和人胚肺纖維正常細(xì)胞(HELF)購于ATCC，這些細(xì)胞株用于細(xì)胞毒性和靶向性實(shí)驗(yàn)。以上細(xì)胞均置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7、MDA-MB-231和HELF 用DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，A549用RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)基中各含10 g·L-1胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素。

動物：SPF級ICR小鼠，5只，♀♂各半，體質(zhì)量18 g～22 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，合格證號：2010002600621。

1.2 試劑 紫杉醇、葉酸、谷氨酸、氨基PEG和熒光染料5AF購于Sigma公司；溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)、RPMI 1640、DMEM、小牛血清、胎牛血清購于南京凱基試劑公司。以上試劑純度均在95%以上。實(shí)驗(yàn)中所用液體試劑均為分析純。

1.3 儀器 ZS-紫外分析攝影儀器180(中國遠(yuǎn)明公司)，LC-MS(Triple QuadTM3500質(zhì)譜系統(tǒng), 美國)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，流式細(xì)胞儀(美國 BD公司)，U-3310型紫外分光光度儀(上海天肯貿(mào)易有限公司)。2 方法

2.1 谷氨酸-紫杉醇(Glu-PTX)的合成 稱取100 mg(0.117 mmol)PTX溶于15 mL的二氯甲烷溶劑(DCM)，同時加入59.7 mg(0.1404 mmol,1.2 eqv)芴甲氧羰基-L-谷氨酸5叔丁酯[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]和14.29 mg(0.117 mmol,1 eqv) 催化劑DMAP。將44.85 mg(0.234 mmol, 2 eqv) 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于10 mL DCM中，在冰浴條件下，將10 mL溶于EDC溶液，緩慢滴入PTX反應(yīng)體系中，大約25 min滴加完畢，除去冰浴。室溫下攪拌21 h。待反應(yīng)完后用同體積的DCM稀釋，然后用同體積的蒸餾水洗2次，加入無水硫酸鎂干燥，真空旋蒸后得晶狀體產(chǎn)物Fmoc-谷氨酸-紫杉醇，將4 mL DCM Fmoc-Glu(OtBu)-PTX溶液中，加入體積20 mL·L-1的哌啶，在室溫條件下攪拌10 h，溶液開始變渾濁，點(diǎn)TLC(乙酸乙酯 ∶石油醚=2 ∶1)跟蹤，反應(yīng)完畢后，真空旋蒸，用乙醚萃取，真空抽濾，旋蒸，得到粉末狀的產(chǎn)物-NH2-Glu(OtBu)-PTX，純度為98%。

2.2 葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥[FA-PEG-Glu-PTX]的制備 如Fig 1所示，活化葉酸的羧基，加入DCC和NHS[摩爾比為 FA ∶DCC ∶NHS=1 ∶1.2 ∶2]，避光50 ℃攪拌6 h，反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液減壓濾過副產(chǎn)物DCU。取上清，用4倍的丙酮萃取活化的葉酸。然后將活化后的葉酸(44.1 mg，0.1 mmol)溶于2 mL DMSO，并加入3 mL含128.54 mg-NH2-Glu(OtBu)-PTX(0.1 mmol)的DMSO 溶液， 常溫攪拌12 h，將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱純化，去除沒有共價偶聯(lián)的葉酸和-NH2-Glu(OtBu)-PTX片段，得到純化的葉酸-谷氨酸-紫杉醇(FA-Glu(OtBu)-PTX前藥。將FA-Glu(OtBu)-PTX溶于7 mL DCM，在通風(fēng)櫥內(nèi)加3 mL三氟乙酸，室溫攪拌，TLC跟蹤。反應(yīng)完全后，將產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用適量乙醚萃取過夜，將乙醚旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，烘干產(chǎn)物，得到FA-Glu(COOH)-PTX。

Fig 1 Synthetic scheme and structures of FA-PEG-Glu-PTX

將葉酸-谷氨酸-紫杉醇溶于4 mL DMSO中，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和NHS[摩爾比為FA-Glu(COOH)-PTX ∶DCC ∶NHS=1 ∶1.2 ∶2]，室溫攪拌4 h，加入1 mL 0.1mmol氨基PEG, 室溫攪拌14 h(Fig 1)，將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱純化，得到純化的葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇，其純度為95%。

2.3 FA-PEG-Glu-PTX的表征 用LC-MS對紫杉醇前藥及中間體進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

2.4 FA-PEG-Glu-PTX的水溶性測定 稱取2.0 mg紫杉醇溶于2 mL甲醇中，配成1 mg·L-1的溶液，并稀釋成5～50 mg·L-1的6個標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度梯度分別為5、10、20、30、40、50 mg·L-1，以甲醇為空白試劑，用紫外分光光度儀測定在PTX的最佳紫外吸收波長處相應(yīng)的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，繪制PTX標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求得其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，繪制紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取100 mg樣品，置于10 mL小容量瓶中，用微量注射器每次加水50 μL觀察溶解情況，直到不溶為止，統(tǒng)計溶解100 mg前藥樣品所需的水量，根據(jù)紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品在水中的溶解度[9]。2.5 FA-PEG-Glu-PTX藥物釋放動力學(xué)曲線測定 準(zhǔn)確稱取紫杉醇2.0 mg溶于2 mL甲醇中， 配成1 g·L-1的溶液,并稀釋成5～50 mg·L-16個標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度梯度分別為5、10、20、30、40、50 g·L-1。分別向高效液相色譜儀進(jìn)樣20 μL，測定紫杉醇峰面積，繪制紫杉醇峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將FA-PEG-Glu-PTX孵育在37℃的PBS、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液中，按照不同的時間點(diǎn)，取100 μL樣品，用1 mL乙酸乙酯萃取PTX，用氮?dú)獯蹈珊?，加?00 μL甲醇，再用HPLC測量PTX峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算PTX含量，與前藥中原始紫杉醇含量對比，計算PTX的釋放率。

2.6 FA-PEG-Glu-PTX前藥的細(xì)胞攝取量 用Western blot技術(shù)測試正常細(xì)胞HELF和3種腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231、A549和 MCF7的葉酸受體(FR)蛋白的表達(dá)水平。用熒光染料5AF標(biāo)記葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥，制備葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇-5AF前藥(葉酸-Glu-PTX-FITC)，并將標(biāo)記后前藥的PBS水溶液(0.2 g·L-1)孵育在4種細(xì)胞(HELF、MDA-MB-231、A549、MCF-7)中12 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察前藥進(jìn)入細(xì)胞狀況，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

2.7 FA-PEG-Glu-PTX細(xì)胞毒性的研究 將乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌細(xì)胞A549和正常細(xì)胞HELF接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞1×104個，培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)12 h后，分別取1 μL PTX、PEG-Glu-PTX、FA-PEG-Glu-PTX加入MCF-7細(xì)胞和正常細(xì)胞HELF，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)24 h的細(xì)胞培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液用移液槍盡量吸干，取MTT，用含血清的DEME培養(yǎng)液配成5 g·L-1的溶液，加入上述體系。每孔加100 μL，室溫放置2 h，用 DMSO終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(OD值)，測定波長為λ=490 nm，測定不同藥物對3種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞HELF的細(xì)胞抑制率[9]。

3 結(jié)果

3.1 水溶性前藥及中間產(chǎn)物的表征 谷氨酸-紫杉醇中間體(Glu-PTX)結(jié)構(gòu)鑒定(Fig 2)。純化后的-NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析，其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與-NH2-Glu(OtBu)-PTX的理論分子質(zhì)量1 283.4完全一致，證明已成功合成谷氨酸-紫杉醇中間體。

3.2 FA-PEG-Glu-PTX前藥結(jié)構(gòu)鑒定 用LC-MS鑒定FA-PEG-Glu-PTX分子質(zhì)量，鑒定結(jié)果與FA-PEG-Glu-PTX的理論分子質(zhì)量1 791.44完全一致(Fig 3)，F(xiàn)A-PEG-Glu-PTX: MS (ESI, m/z): 1 791.44([M + H]+)。

3.3 FA-PEG-Glu-PTX的水溶性 按照上述PTX前藥溶解度的計算方法，根據(jù)PTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.776 96+0.035 08X(r2=0.999 01)，重復(fù)3次，F(xiàn)A-PEG-Glu-PTX的溶解度為(6.08±0.14) g·L-1，與PTX原藥(0.4 mg·L-1)相比，用多個水溶性小分子共價偶聯(lián)PTX，大大提高了PTX原藥的溶解性。

3.4 FA-PEG-Glu-PTX在不同溶液中釋藥動力學(xué)曲線 用HPLC測定紫杉醇峰面積，繪制出紫杉醇峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸曲線方程為Y=65 535.650 35+17 388.998 22X(r2=0.999)。紫杉醇前藥分別在PBS、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育4 h后，原藥釋放率分別是14.6%、23.8%和37.8%。由Fig 4可以看出,前藥在PBS中釋放速度最慢，在細(xì)胞培養(yǎng)液中釋放速度最快，在血漿中的釋放速度處于中間狀態(tài)，這與細(xì)胞培養(yǎng)液和血漿中含活性酶有關(guān)。3.5 葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇-FITC(FA-Glu-PTX-FITC)的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 在2種腫瘤細(xì)胞和1種正常細(xì)胞中，葉酸受體蛋白表達(dá)量的順序?yàn)椋篗DA-MB-231>MCF-7>A549>HELF (Fig 5A)。葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇-5AF前藥(FA-PEG-Glu-PTX-5AF)在3種腫瘤細(xì)胞和1種正常細(xì)胞中孵育 12 h后，在熒光顯微鏡下可以看到前藥在葉酸配體-受體介導(dǎo)下進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并顯示出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，而在正常細(xì)胞HELF中幾乎看不到熒光(Fig 5B)。用流式細(xì)胞儀定量分析前藥在MDA-MB-231、MCF-7、A549和HELF細(xì)胞中的攝取率分別為79.2%、64.1%、53.1%和6.8%，紫杉醇前藥在MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞中攝取量大于MCF-7和A549，3種腫瘤細(xì)胞的攝取量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常細(xì)胞，且4種細(xì)胞對前藥攝取量的順序?yàn)椋篗DA-MB-231>MCF-7>A549>HELF(Fig 5C)，這與4種細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)量的順序是一致的，說明紫杉醇前藥可在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體的介導(dǎo)下靶向腫瘤細(xì)胞。

Fig 2 Primary mass spectrum of-NH2-Glu(OtBu)-PTX.-NH2-Glu(OtBu)-PTX MS(ESI,m/z):1283.4([M+Na]+)

Fig 3 Primary mass spectrum of FA-PEG-Glu-PTX

Fig 4 HPLC of PTX from FA-PEG-Glu-PTX at 4 h incubation in rat plasma(CH3OH)

A:Release of PTX from FA-PEG-Glu-PTX at 4 h incubation in rat plasma(CH3OH) is 23.8%;B: Release of PTX from FA-PEG-Glu-PTX under different media

3.6 FA-PEG-Glu-PTX的細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn) Fig 6中，紫杉醇前藥FA-PEG-Glu-PTX在正常細(xì)胞HELF中的細(xì)胞生存率明顯高于PEG-Glu-PTX和PTX，表明 FA-PEG-Glu-PTX前藥的細(xì)胞毒性小于PTX，但FA-PEG-Glu-PTX紫杉醇前藥在3種腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞生存率低于PEG-Glu-PTX和PTX，說明FA-PEG-Glu-PTX與PTX原藥相比較，在葉酸受體的介導(dǎo)下靶向葉酸受體表達(dá)量較高的腫瘤細(xì)胞，從而殺死腫瘤細(xì)胞，對葉酸受體表達(dá)量較低的正常細(xì)胞毒性較小。

4 討論

當(dāng)今對惡性腫瘤臨床治療手段主要是手術(shù)結(jié)合化學(xué)藥物治療。紫杉醇是療效最確切的一線廣譜抗癌藥物，同時也是治療乳腺癌最好的化療藥物之一，但由于紫杉醇本身的水溶性極差，在臨床上使用時 所用溶劑為聚氧乙烯蓖麻油和乙醇的混合物，導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用，限制了紫杉醇藥物在臨床上的應(yīng)用[11-13]。

Fig 5 Targeting capability of fluorescence dye labeled PTX prodrugs in different tumor cell lines with different levels of expression of FA-α receptors

A:Protein levels of FR-α on the tumor and normal cell lines were determined by Western blot;B:Targeting ability of PTX prodrugs in MDA-MB-231, MCF-7, A549 and HELF cells(40×).Tumor cells showed increased uptake of PTX prodrug compared to the normal cell line with low FR protein expression;C:Flow cytometric analysis of FA-modified PTX prodrug in MDA-MB-231, MCF-7, A549 and HELF cells. FA-PEG-Glu-PTX-FITC prodrugs were uptaken into four cell lines about 79.2%，64.1%，53.1% and 6.8%.

Fig 6 Antitumor and cytotoxic effects of FA-PEG-Glu-PTX on tumor cell lines and normal cell line HELF by cell viability ratio assay( n=6)

對于紫杉醇藥物的改造主要集中在藥物靶向前藥的設(shè)計，用大分子作為紫杉醇的藥物載體，并取得一定進(jìn)展，如白蛋白-紫杉醇前藥，但無論是大分子蛋白還是其它大分子材料作為難溶性藥物載體都會誘導(dǎo)機(jī)體免疫原毒性，且大分子材料作為抗腫瘤藥物劑型，存在包封率低、易滲漏、穩(wěn)定性差等問題[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)制備由多個功能性小分子通過共價偶聯(lián)作為紫杉醇的載體，成功合成葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥，其中葉酸作為“導(dǎo)向基團(tuán)”，氨基PEG具有增溶劑和穩(wěn)定劑的作用，氨基酸作為連接葉酸、氨基PEG和紫杉醇的Linker。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明多個水溶性較好的小分子偶合物可增加紫杉醇前藥的水溶性,前藥的溶解度為(6.08±0.14) g·L-1，是紫杉醇原藥溶解度(0.4 mg·L-1)[15]的1×104倍。葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥在PBS中釋放藥物速度最慢，在細(xì)胞培養(yǎng)液中釋放的速度最快，血漿中釋放速度處于兩者之間，4 h可達(dá)到峰值，這為藥物在體內(nèi)滯留提供了充足的時間。通過對正常細(xì)胞和3種腫瘤細(xì)胞葉酸受體蛋白表達(dá)檢測，可發(fā)現(xiàn)3種腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞表面受體表達(dá)量，這與紫杉醇前藥在3種腫瘤細(xì)胞中有較高攝取量是一致的。同樣MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示紫杉醇前藥對3種腫瘤細(xì)胞抑制率高于正常細(xì)胞，證明葉酸-PEG-谷氨酸-紫杉醇前藥在葉酸配體-受體介導(dǎo)下，靶向葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，而對葉酸受體表達(dá)較少的正常細(xì)胞毒性減小。

總之， 用多個功能性小分子修飾能提高紫杉醇前藥的水溶性，并可在配體-受體的介導(dǎo)下，靶向腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為開拓新型靶向性藥物傳遞系統(tǒng)提供了新途徑。

(致謝：感謝宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所藥物分析實(shí)驗(yàn)室為本項研究提供實(shí)驗(yàn)條件。)

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Preparation of anti-cancer water-soluble paclitaxel prodrug and its anti-cancer effect

ZHAO Su-hua1, YANG Xiu-qin2, ZHU Wei2, ZHENG Peng-cheng2,WANG Jin-jing2,SHAN Ling-ling2

(1.DeptofAnimalScience，SuzhouVocationalandTechnicalCollege,SuzhouAnhui234000,China; 2.InstituteofPharmaceuticalBiotechnology,SchoolofBiologyandFoodEngineering,SuzhouUniversity,SuzhouAnhui234000,China)

Aim Paclitaxel(PTX) has shown an effect against human cancer. However, serious drawbacks hamper PTX clinical use. Overcoming paclitaxel limitations is one of the best approaches to enhance water solubility.Methods In this study, water-soluble paclitaxel prodrug was prepared, folic acid-polyethylene glycol-glutamic-paclitaxel(FA-PEG-Glu-PTX) composed of folic acid(FA, target), amino acids(Glu, linker), and polyethylene glycol(PEG) in order to improve the solubilization and stability. The chemical structure and physicochemical property of prodrug were measured by LC-MS, solubility, drug release rate to evaluate the antitumor activity and cytotoxicity of FA-PEG-Glu-PTX. MTT assays were conducted on MDA-MB-231, MCF-7, A549 and HELF cell lines. FA-PEG-Glu-PTX prodrugs were labeled with 5 amino fluorescence visible fluorescent dye(5AF) for fluorescence microscopy.Results The successful conjugation of FA-PEG-Glu-PTX was confirmed by LC-MS, and had better water solubility, release rate curve.Invitrostudies indicated that foliate receptor(FR-α) mediated uptake of PTX-conjugated multi-small molecules carriers induced highly targeting ability, and antitumor activity, as well as reduced side toxicity effects of PTX. Conclusion FA-PEG-Glu-PTX has a good antitumor activity.

folic acid；paclitaxel prodrug；water-soluble; MTT test；tumor cells；targeting property

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.030.html

2016-08-10,

2016-09-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31400307);安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)研究項目(No KJ2014A249)

趙素華(1965-)， 女,博士生，副教授,研究方向:藥物化學(xué)，E-mail:llwz0525@126.com; 單玲玲(1971-),女，博士，副教授，研究方向：腫瘤靶向探針及藥物的合成,通訊作者,E-mail:414286713@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.015

A

1001-1978(2016)12-1711-07

R282.71 ；R329.24；R977.6；R979.1