尼可地爾對抗高糖引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)

陳美姬，梁偉杰，李健豪，鄭東誕，蘭 軍，陳景福，廖新學(xué)

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院兒科，廣東 廣州 510700；2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，3.廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400；4. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州 510700；5.東莞市第三人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，6. 東莞市心血管疾病研究所，廣東 東莞 523326；7. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

尼可地爾對抗高糖引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)

陳美姬1，梁偉杰2,3，李健豪2,3，鄭東誕4，蘭 軍5,6，陳景福4，廖新學(xué)7

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院兒科，廣東 廣州 510700；2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，3.廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400；4. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州 510700；5.東莞市第三人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，6. 東莞市心血管疾病研究所，廣東 東莞 523326；7. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

目的 探討尼可地爾(nicorandil，Nic)能否通過調(diào)控核因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)/環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)通路對抗高糖引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷和炎癥。方法 應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)盒(CCK-8)檢測心肌細(xì)胞存活率；蛋白質(zhì)免疫印跡法測定NF-κB、COX-2和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性；雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相法測定胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平；Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法測定凋亡細(xì)胞數(shù)量；羅丹明 123染色熒光顯微鏡照相法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)；ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。結(jié)果 35 mmol·L-1葡萄糖(高糖，HG)作用H9c2 心肌細(xì)胞24 h能明顯降低心肌細(xì)胞存活率。在HG作用前，應(yīng)用20～100 μmol·L-1Nic預(yù)處理60 min或50 μmol·L-1Nic預(yù)處理30～120 min均可明顯對抗HG對心肌細(xì)胞存活率的抑制作用。另一方面，HG可上調(diào)心肌細(xì)胞磷酸化(p)-NF-κB p65和COX-2的表達(dá)，50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min能抑制HG誘導(dǎo)的p-NF-κB p65和COX-2表達(dá)的上調(diào)。此外，HG作用心肌細(xì)胞24 h可引起明顯的心肌細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，使培養(yǎng)液中LDH活性、ROS生成、凋亡細(xì)胞數(shù)量、cleaved caspase-3表達(dá)、MMP丟失及炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌均增加；在HG作用前，應(yīng)用50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min或應(yīng)用100 μmol·L-1PDTC(NF-κB抑制劑)或10 μmol·L-1NS-398(COX-2抑制劑)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h能明顯拮抗HG引起的上述損傷和炎癥反應(yīng)。結(jié)論 Nic通過抑制NF-κB/COX-2通路對抗HG引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷和炎癥。

尼可地爾；核因子-κB；環(huán)氧化酶-2；高糖；心肌細(xì)胞；損傷；炎癥

高血糖不僅是糖尿病的一個(gè)重要指征，其所誘導(dǎo)的心肌損傷及炎癥反應(yīng)在糖尿病心血管并發(fā)癥如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的作用[1]。研究表明，在DCM患者或糖尿病動物及離體細(xì)胞模型中，持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)伴隨大量的炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的分泌及與炎癥相關(guān)的信號分子如Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等的激活，最終導(dǎo)致心肌損害發(fā)生[2-5]。因此，積極研發(fā)及尋找對抗炎癥反應(yīng)的藥物，有望成為防治糖尿病心血管并發(fā)癥的一個(gè)突破口。尼可地爾(nicorandil，Nic)是ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channel，KATP通道)的開放劑，同時(shí)還具有類硝酸酯的作用，是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗心絞痛藥物[6]。研究表明，Nic具有抗炎作用，能抑制TLR4[7]、NF-κB[8]等炎癥信號分子的活動從而實(shí)現(xiàn)器官保護(hù)。近年來，Nic在對抗糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥中的作用得到了極大的關(guān)注[9-11]。例如：Nic不僅能減輕球囊導(dǎo)管機(jī)械損傷動脈導(dǎo)致的糖尿病大鼠血管內(nèi)皮增生，而且能抑制HG誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[9]；應(yīng)用Nic可減輕鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激及血管細(xì)胞粘附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的分泌[10]；擇期進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)的糖尿病患者，口服Nic可減輕PCI相關(guān)的心肌損傷，改善心臟功能[11]。Nic的心血管保護(hù)作用與其開放KATP通道有關(guān)。最近，我們研究證實(shí)，開放KATP通道能對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷[12-13]。然而，在高糖狀態(tài)下，Nic能否保護(hù)心肌細(xì)胞對抗高糖誘導(dǎo)的損傷和炎癥，其心肌保護(hù)作用能否通過抑制NF-κB、COX-2等炎癥信號分子的活動而實(shí)現(xiàn)，目前尚未完全清楚。

為此本研究在高糖損傷H9c2 心肌細(xì)胞模型[14]中探討：(1)Nic能否對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥；(2)Nic的心肌保護(hù)作用是否與抑制NF-κB/COX-2通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 抗磷酸化(p)-NF-κB p65和抗總(t)-NF-κB p65抗體、抗COX-2抗體、抗cleaved caspase-3抗體來源于Cell Signaling(美國)；二硫代氨基甲酸吡咯烷(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC，NF-κB抑制劑)、Nic、羅丹明123(Rhodamine 123，Rh 123)、雙氯熒光素(2′， 7′-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)、NS-398(COX-2抑制劑)、Hoechst 33258、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自Sigma-Aldrich公司(美國)；特級胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco BRL(美國)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counter kit-8, CCK-8)購自Dojindo Lab(日本)；DMEM培養(yǎng)基(其葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1)由Hyclone公司(美國)供應(yīng)；IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。H9c2 心肌細(xì)胞來源于胚胎期大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫供應(yīng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 H9c2 心肌細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃的條件下傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約80%的融合狀態(tài)可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為8組：(1)對照(Control)組：DMEM培養(yǎng)基作用心肌細(xì)胞24 h；(2)高糖(high glucose, HG)組：35 mmol·L-1葡萄糖處理心肌細(xì)胞24 h；(3)Nic+HG組：50 μmol·L-1Nic作用心肌細(xì)胞60 min，PBS液洗2次，然后HG處理24 h；(4)PDTC+HG組：100 μmol·L-1PDTC與HG共處理心肌細(xì)胞24 h；(5)NS-398+HG組：10 μmol·L-1NS-398與HG共處理心肌細(xì)胞24 h；(6)Nic組：50 μmol·L-1Nic作用心肌細(xì)胞60 min，PBS液洗2次，然后DMEM處理24 h；(7)PDTC組：100 μmol·L-1PDTC與DMEM共處理心肌細(xì)胞24 h；(8)NS-398組：10 μmol·L-1NS-398與DMEM共處理心肌細(xì)胞24 h。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測NF-κB、COX-2和cleaved caspase-3的表達(dá)水平 H9c2 心肌細(xì)胞在60 mm培養(yǎng)皿中生長至融合度約80%時(shí)，根據(jù)分組給予相應(yīng)處理后，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃搖床上處理30 min，11 400×g高速離心10 min，BCA法測定蛋白質(zhì)含量。等量的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗，即兔抗鼠p-NF-κB p65、t-NF-κB p65、COX-2、cleaved caspase-3或GAPDH(濃度均為1 ∶1 000)，4 ℃作用過夜后加入濃度為1 ∶2 500的Ⅱ抗稀釋液，室溫下孵育1.5 h。ECL法使PVDF膜顯色，暗室中曝光到X線片上，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4 CCK-8法測定心肌細(xì)胞存活率 H9c2 心肌細(xì)胞在96孔板中生長至融合度約80%時(shí)，按照設(shè)定的分組處理后，每孔加入DMEM 90 μL和CCK-8 溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h，酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光度值(A)。細(xì)胞存活率按照以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率/%=處理組A/對照組A×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 LDH試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性 H9c2心肌細(xì)胞在96孔板中生長至融合度約80%時(shí)，按照設(shè)定的分組分別處理后，嚴(yán)格按照LDH試劑盒說明書介紹的步驟，檢測并計(jì)算出培養(yǎng)液中LDH的活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法測定胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平 H9c2 心肌細(xì)胞在24孔板中生長至融合度約80%時(shí)，按照分組給予相應(yīng)處理后，加入DCFH-DA染液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon，日本)下隨機(jī)照片記錄5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用圖像分析軟件(Image J 1.47i)計(jì)算出綠色熒光強(qiáng)度的平均值，平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity，MFI)，其數(shù)值大小能間接反映ROS水平的高低，再對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.7 Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量 H9c2心肌細(xì)胞在24孔板中生長至約80%的融合度時(shí)，按分組給予相應(yīng)處理后，多聚甲醛固定10 min，隨后Hoechst 33258染料作用30 min，在熒光顯微鏡下可觀察到：正常心肌細(xì)胞核呈彌散均勻低密度熒光，凋亡細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞核呈濃縮致密的顆粒塊狀熒光。隨機(jī)照片記錄5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用Image J 1.47i計(jì)算出藍(lán)色熒光的MFI，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.8 Rh 123 染色熒光顯微鏡照相法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP) H9c2心肌細(xì)胞在24孔板中生長至約80%的融合度時(shí)，按照分組給予相應(yīng)的處理后，加入Rh 123 緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育45 min，熒光顯微鏡下隨機(jī)照片記錄5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算出綠色熒光的MFI(數(shù)值大小可反映MMP的高低)，再對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.9 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的水平 H9c2心肌細(xì)胞在96孔板中生長至融合度約80%時(shí)，按照分組給予不同處理后，收集培養(yǎng)基作待測標(biāo)本，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定出細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 Nic抑制HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率下降 為選擇Nic的最佳作用濃度及預(yù)處理時(shí)間，本研究首先選擇Nic的不同濃度及預(yù)處理時(shí)間在HG處理的心肌細(xì)胞模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Fig 1A結(jié)果顯示，高糖作用心肌細(xì)胞24 h可明顯降低心肌細(xì)胞存活率。20～100 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min均可明顯升高細(xì)胞存活率，與HG處理組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中濃度在50 μmol·L-1時(shí)，Nic升高細(xì)胞存活率作用最明顯，因此本研究觀察50 μmol·L-1Nic在不同預(yù)處理時(shí)間的心肌細(xì)胞保護(hù)作用。Fig 1B顯示，從預(yù)處理30 min開始，Nic可對抗HG對心肌細(xì)胞存活率的抑制作用，使細(xì)胞存活率升高，其中預(yù)處理60 min時(shí)的作用最明顯，預(yù)處理90和120 min，升高細(xì)胞存活率的作用雖有所降低，但仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。根據(jù)上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選用50 μmol·L-1和預(yù)處理60 min作為Nic后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度及預(yù)處理時(shí)間。

2.2 Nic抑制HG對心肌細(xì)胞NF-κB和COX-2表達(dá)的上調(diào)作用 Fig 2顯示，HG作用心肌細(xì)胞24 h可使心肌細(xì)胞磷酸化(p)-NF-κB p65和COX-2的表達(dá)水平明顯上升；在HG作用前，應(yīng)用50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min，p-NF-κB p65和COX-2的表達(dá)水平均有所下降，與HG組分別比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μmol·L-1Nic本身對心肌細(xì)胞p-NF-κB p65和COX-2的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯的影響。

我的教學(xué)設(shè)計(jì)借鑒了曹老師的許多理念，努力創(chuàng)造“智趣”課堂，從導(dǎo)入到識字教學(xué)，再到閱讀理解、寫字指導(dǎo)，都努力營造一個(gè)充滿情趣的情境，把抽象的文字符號變成生動活潑的畫面，讓靜態(tài)的語言文字跳動起來。通過聽聲音、看字形、看圖片等方法猜字識字是《咕咚》第一課時(shí)的教學(xué)重點(diǎn)，引導(dǎo)學(xué)生理解文中如“拔腿就跑”等詞語是難點(diǎn)。我運(yùn)用傳統(tǒng)的隨文識字方法進(jìn)行教學(xué)，學(xué)生能夠猜出一些生字的讀音，再讓他們在回答的基礎(chǔ)上總結(jié)歸納，培養(yǎng)識字能力。

Fig 1 Nicorandil (Nic) attenuates high glucose (HG)-induced decrease in cell viability in H9c2 cardiac cells (n=5)

H9c2 cardiac cells were pre-treated with Nic at different concentrations and different time before exposure to HG for 24 h.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.3 Nic、NF-κB和COX-2的抑制劑減輕HG誘導(dǎo)的LDH活性增加 HG作用心肌細(xì)胞24 h，培養(yǎng)液中的LDH活性明顯增加，與Control組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 3)。在HG作用前，應(yīng)用50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min可減少LDH的活性，與HG組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Nic的作用相類似，100 μmol·L-1PDTC(NF-κB抑制劑)或10 μmol·L-1NS-398(COX-2抑制劑)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也可減少LDH的活性，與HG組分別比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μmol·L-1Nic、100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398本身對LDH的活性無明顯的影響。

2.4 Nic、NF-κB和COX-2的抑制劑減輕HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS堆積 Fig 4B顯示，HG作用H9c2 心肌細(xì)胞24 h可使胞內(nèi)DCFH-DA的MFI明顯增強(qiáng)，與Control組(Fig 4A)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(P<0.01)。然而，在HG作用前，50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min，可使MFI明顯降低(Fig 4C)，與HG組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Nic作用相類似，100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能使DCFH-DA的MFI明顯降低，分別與HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μmol·L-1Nic、100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398本身對心肌細(xì)胞ROS的基礎(chǔ)生成無明顯的影響(P>0.05)。

Fig 2 Nic attenuates HG-induced up-regulation of phosphorated (p)-NF-κB p65 and COX-2 protein expression in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nic 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: Nic 50 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group

2.5 Nic、NF-κB和COX-2的抑制劑減輕HG引起的致心肌細(xì)胞凋亡作用 HG作用心肌細(xì)胞24 h后，經(jīng)Hoechst 33258核染色，在熒光顯微鏡下可觀 察到典型凋亡特征的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(Fig 5B)，與Control組(Fig 5A)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。然而50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min再予HG作用心肌細(xì)胞24 h，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與HG處理組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 5C)。與Nic作用相類似，100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，與HG組分別比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Nic、PDTC或NS-398本身對細(xì)胞凋亡數(shù)量無明顯的影響。

Fig 3 Nic, inhibitors of NF-κB and COX-2 attenuate HG-induced increase in activity of lactate dehydrogenase (LDH) in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nic 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: PDTC 100 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NS-398 10 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; F: Nic 50 μmol·L-1; G: PDTC 100 μmol·L-1; H: NS-398 10 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group

另一方面，HG可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的終末效應(yīng)器cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增多；應(yīng)用50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min然后再予HG作用24 h，或應(yīng)用100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398和HG共處理心肌細(xì)胞24 h均可減輕HG對cleaved caspase-3表達(dá)的上調(diào)，分別與HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μmol·L-1Nic、100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398本身對心肌細(xì)胞cleaved caspase-3的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯的影響(P>0.05)。

2.6 Nic、NF-κB和COX-2的抑制劑減輕HG引起的心肌細(xì)胞MMP丟失 HG作用心肌細(xì)胞24 h，可使心肌細(xì)胞內(nèi)Rh 123 的MFI從(29.6±1.36)%(Control組，F(xiàn)ig 6A)降低至(8.7±0.90)%(HG組，F(xiàn)ig 6B)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在HG作用前，采用50 μmol·L-1Nic預(yù)處 理心肌細(xì)胞60 min，可使MFI升高至(19.8±1.24)%(Fig 6C)，與HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Nic作用相類似，100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，MFI也可明顯升高，分別為(20.6±0.77)%和(21.3±0.83)%，與HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。50 μmol·L-1Nic、100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398本身對心肌細(xì)胞MMP無明顯的影響(P>0.05)。

Fig 4 Nic, inhibitors of NF-κB and COX-2 attenuate HG-induced increase in intracellular ROS generation in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nic 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: PDTC 100 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NS-398 10 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; F: Nic 50 μmol·L-1; G: PDTC 100 μmol·L-1; H: NS-398 10 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group

Fig 5 Nic, Inhibitors of NF-κB and COX-2 attenuate HG-induced apoptosis in H9c2 cardiac cells (n=5)

(Ⅰ) The changes of apoptotic cells were detected by Hoechst 33258 nuclear staining. (Ⅱ) The levels of cleaved caspase-3 were measured by Western blot. A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nic 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: PDTC 100 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NS-398 10 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; F: Nic 50 μmol·L-1; G: PDTC 100 μmol·L-1; H: NS-398 10 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

Fig 6 Nic, nhibitors of NF-κB and COX-2 attenuate HG-induced dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nic 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: PDTC 100 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NS-398 10 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; F: Nic 50 μmol·L-1; G: PDTC 100 μmol·L-1; H: NS-398 10 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.7 Nic、NF-κB和COX-2的抑制劑減輕HG誘導(dǎo)的炎癥因子分泌 如Fig 7所示，HG處理心肌細(xì)胞24 h可使炎癥因子IL-1β(Fig 7A)和TNF-α(Fig 7B)的分泌水平明顯升高，與Control組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在HG作用前，采用50 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞60 min可使IL-1β和TNF-α的分泌水平明顯降低，與HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Nic的作用相類似，100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能使IL-1β和TNF-α的分泌水平降低，分別與HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μmol·L-1Nic、100 μmol·L-1PDTC或10 μmol·L-1NS-398本身不影響炎癥因子的基礎(chǔ)分泌水平。

3 討論

Nic不僅是一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗心絞痛藥物，更因?yàn)槠淠芡ㄟ^開放KATP通道從而保護(hù)心臟對抗缺血引起的損傷[6,15-16]而得到了國內(nèi)外學(xué)者的重視。最近Nic因其能對抗糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥[9-11]引起了廣泛的關(guān)注。我們研究證實(shí)，開放KATP通道能保護(hù)H9c2 心肌細(xì)胞對抗高糖引起的損傷[12-13]，因此我們推測Nic也可能有對抗HG損傷心肌細(xì)胞的作用。為此我們觀察了Nic對HG誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和炎癥的影響。結(jié)果顯示，20～100 μmol·L-1Nic預(yù)處理心肌細(xì)胞均可對抗HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性，升高心肌細(xì)胞存活率，其中濃度在50 μmol·L-1時(shí)Nic對抗HG致細(xì)胞毒性作用最明顯。此外Nic能減輕HG誘導(dǎo)的多種損傷，使LDH活性降低，ROS生成、凋亡細(xì)胞數(shù)量、cleaved caspase-3表達(dá)、MMP丟失及炎癥因子(IL-1β和TNF-α)的分泌均減少。上述結(jié)果清晰地提示：Nic能保護(hù)H9c2 心肌細(xì)胞對抗HG引起的損傷和炎癥，這為臨床上應(yīng)用Nic防治糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)并擴(kuò)寬了思路，具有重要的理論和臨床意義。

重要的是，我們進(jìn)一步探討了Nic保護(hù)心肌細(xì)胞對抗HG引起的損傷和炎癥的作用機(jī)制。炎癥反 應(yīng)是高血糖引起心肌損傷的重要的病理生理機(jī)制之一。在炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中，NF-κB和COX-2等信號分子發(fā)揮重要的作用。NF-κB是炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要始動因素，能夠調(diào)節(jié)多種參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄，其下游的一個(gè)重要信號之一是COX-2[17]。COX-2 在生理狀態(tài)下鮮有表達(dá)，在炎癥、缺血/缺氧、高血糖等病理狀態(tài)下則表達(dá)明顯增多，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。我們已證實(shí)，HG可激活NF-κB和COX-2通路，抑制NF-κB和COX-2的活性可減輕HG引起的心肌細(xì)胞損傷[4,18]。然而，尼可地爾能否通過抑制NF-κB/COX-2通路從而保護(hù)心肌細(xì)胞對抗HG引起的損傷和炎癥目前尚未見報(bào)道。Kawamura等[8]指出，Nic可通過抑制冠狀動脈搭橋術(shù)后患者NF-κB的活動，從而減少炎癥細(xì)胞因子的分泌、減輕心肌再灌注損傷，因此我們推測Nic可能對NF-κB及其下游的COX-2通路有調(diào)控作用。為此我們首先探討了Nic對HG上調(diào)p-NF-κB p65和COX-2表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，Nic能抑制HG對心肌細(xì)胞p-NF-κB p65和COX-2表達(dá)的上調(diào)作用；此外，應(yīng)用PDTC抑制NF-κB和應(yīng)用NS-398抑制COX-2的活動均能產(chǎn)生類似Nic的心肌保護(hù)作用，使LDH活性、ROS生成、凋亡細(xì)胞數(shù)量、cleaved caspase-3表達(dá)、MMP丟失及炎癥因子的分泌均減少。上述結(jié)果提示，抑制NF-κB/COX-2通路的活動可能是Nic保護(hù)心肌細(xì)胞對抗HG引起的損傷和炎癥的重要機(jī)制之一。有趣的是，Tang等[19]報(bào)道，在心肌梗死的兔模型中，Nic通過上調(diào)COX-2表達(dá)產(chǎn)生延遲相心肌保護(hù)作用。我們的結(jié)果和Tang等[19]的結(jié)果不一致，可能與COX-2在不同的疾病模型中發(fā)揮不同的作用有關(guān)。

Fig 7 Nic, inhibitors of NF-κB and COX-2 attenuate HG-induced secretion of inflammatory cytokines in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nic 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: PDTC 100 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NS-398 10 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; F: Nic 50 μmol·L-1; G: PDTC 100 μmol·L-1; H: NS-398 10 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

綜上所述，本研究在HG損傷H9c2 心肌細(xì)胞的模型中，證實(shí)Nic可保護(hù)心肌細(xì)胞對抗HG誘導(dǎo)的損傷和炎癥反應(yīng)；抑制NF-κB/COX-2通路可能是Nic發(fā)揮心肌保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院科技樓開展，全體作者均參與了實(shí)驗(yàn)。在此非常感謝實(shí)驗(yàn)室各位老師和同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中提供的幫助，尤其感謝馮鑒強(qiáng)教授對本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、文章書寫給予的悉心指導(dǎo)！)

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-12-5 15:14 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.014.html

Nicorandil protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury and inflammation

CHEN Mei-ji1,LIANG Wei-jie2,3,LI Jian-hao2,3,ZHENG Dong-dan4,LAN Jun5,6,CHEN Jing-fu4,LIAO Xin-xue7

(1.DeptofPediatrics,HuangpuDivisionoftheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;2.DeptofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict, 3.CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;4.CardiacCareUnitofDeptofCardiology,HuangpuDivision,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China; 5.DeptofCardiology,theThirdPeople’sHospitalofDongguanCity, 6.CardiovascularInstituteofDongguanCity,DongguanGuangdong523326,China;7.DeptofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Aim To investigate whether nicorandil (Nic) protects H9c2 cardiac cells against high glucose (HG)-induced injury and inflammation by inhibiting nuclear factor-κB (NF-κB)/cyclooxygenase-2 (COX-2) pathway. Methods Cell viability was measured by cell counter kit-8 (CCK-8) assay. The expression levels of NF-κB, COX-2 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium was measured with commercial kits. The intracellular level of reactive oxygen species (ROS) was detected by 2′, 7′-dichlorfluorescein-diacetate (DCFH-DA) staining followed by photofluorography. The number of apoptotic cells was observed by Hoechst 33258 nuclear staining followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was examined by rhodamine 123 staining followed by photofluorography. The secretion levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by ELISA. Results After H9c2 cardiac cells were treated with 35 mmol·L-1glucose (high glucose, HG) for 24 h, the cell viability was significantly decreased. Pre-treatment of the cells with 20～100 μmol·L-1Nic for 60 min or 50 μmol·L-1Nic for 30～120 min before exposure to HG significantly attenuated the decrease in viability induced by HG. On the other hand, HG increased the expression levels of phosphorated (p)-NF-κB p65 and cyclooxygenase-2 (COX-2) in H9c2 cardiac cells. Pre-treatment of the cells with 50 μmol·L-1Nic for 60 min attenuated the up-regulation of p-NF-κB p65 and COX-2 expression levels induced by HG. Furthermore, HG induced considerable injuries and inflammatory response, leading to increases in LDH activity, ROS generation, MMP loss, the number of apoptotic cells, the expression of cleaved caspase-3 as well as the secretion levels of IL-1β and TNF-α. Pre-treatment of the cells with 50 μmol·L-1Nic for 60 min before HG exposure, or co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1PDTC (an inhibitor of NF-κB) or 10 μmol·L-1NS-398 (an inhibitor of COX-2) and HG for 24 h obviously reduced the above injuries and inflammatory response induced by HG. Conclusion Nic protects H9c2 cardiac cells against HG-induced injury and inflammation by inhibiting NF-κB/COX-2 pathway.

nicorandil; nuclear factor-κB; cyclooxygenase-2; high glucose; cardiomyocyte; injury; inflammation

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.012.html

2016-06-08,

2016-09-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81270296)；廣東省財(cái)政科技項(xiàng)目(No 2014SC107)

陳美姬(1975-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：兒童危重癥疾病的救治，E-mail：Chenmeiji_2016@163.com; 廖新學(xué)(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管疾病的損傷與保護(hù)機(jī)制，通訊作者，E-mail：liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.006

A

1001-1978(2016)12-1657-09

R-332；R322.11；R329.24；R345.4；R364.5；R392.11；R542.2；R587.1