離子色譜法與滴定法測定甜菜堿含量的不確定度評估

■索德成 肖志明 田 靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

甜菜堿（betaine）是一種天然的類維生素物質(zhì)，19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)于歐洲,存在于動植物和微生物體內(nèi)。其功效直到20世紀(jì)70年代才漸被認(rèn)可。近年來，在畜禽生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中進(jìn)行了大量的研究：甜菜堿作為高效甲基供體，可以部分替代蛋氨酸；甜菜堿具有抗脂肪肝功能，增強脂肪代謝，改善肉質(zhì)，提高瘦肉率；對水生物攝餌有特殊的刺激和促進(jìn)作用，可以提高采食率，降低餌料系數(shù)，是畜禽水產(chǎn)動物的新型飼料生長促進(jìn)劑[1-2]。因此，準(zhǔn)確檢測甜菜堿的實際含量，對保障產(chǎn)品質(zhì)量意義重大。目前飼料添加劑甜菜堿含量的檢測方法主要有雷氏鹽法、非水滴定法、離子色譜法等[3-4]。目前的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 399—2000使用非水滴定法檢測甜菜堿鹽酸鹽，但是無法對一些摻假物質(zhì)進(jìn)行鑒別。為此，國家標(biāo)準(zhǔn)GB∕T 23710—2009制定了用離子色譜法檢測甜菜堿的方法。在實際工作中，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法對產(chǎn)品檢測結(jié)果具有一定差異，因此需要了解兩種方法誤差產(chǎn)生的原因。

測量不確定度是指表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)測量。測量不確定度分析已經(jīng)作為國際認(rèn)可的實驗結(jié)果評價指標(biāo)，已代替?zhèn)鹘y(tǒng)的測量誤差理論，用以衡量測量結(jié)果的可靠性實驗[5-6]。隨著人們對檢測結(jié)果的可靠性要求不斷提高，對測量不確定度的評價日益關(guān)注和重視。為此我們參考JJF 1059、CNAS-GL06和文獻(xiàn)報道[5-14]，對兩種檢測方法的不確定度進(jìn)行了評定，基本闡明了兩種方法誤差產(chǎn)生主要來源。

1 儀器與方法

1.1 儀器及試劑

戴安2500型離子色譜儀，1、5、10、25 ml A級刻度吸管；50、100 ml A級容量瓶，50 ml酸性滴定管，超聲波清洗器，電子天平（感量0.000 1 g）。甜菜堿純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，標(biāo)準(zhǔn)編號為GBW09540，標(biāo)準(zhǔn)值為99.7%，相對不確定度為0.6%。鄰苯二甲酸氫鉀純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值于中國計量科學(xué)研究院，標(biāo)準(zhǔn)編號為GBW（E）060019k，標(biāo)準(zhǔn)值為99.97%，擴展不確定度為0.02%。其他試劑及相關(guān)化學(xué)品均為分析純。

1.2 測試方法

1.2.1 滴定法測定

按NY 399—2000所提供的方法測定，試樣預(yù)先在105℃烘箱干燥至恒重，稱取干燥試樣0.4 g(精確至0.000 1 g)，加50 ml冰乙酸，加熱至溶解，加25 ml乙酸汞溶液，冷卻，加2滴結(jié)晶紫指示劑，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mol∕l)滴定至溶液呈綠色，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按GB∕T 601—2002提供方法標(biāo)定。稱取105℃干燥恒重的工作基準(zhǔn)試劑鄰苯二甲酸氫鉀0.75 g(精確至0.000 1 g)，置于干燥錐形瓶中，加50 ml冰乙酸，溫?zé)崛芙?。?滴結(jié)晶紫指示液，用配制好的高氯酸溶液滴定至溶液由紫色變?yōu)樗{(lán)色(微帶紫色)。

1.2.2 離子色譜法測定

按GB∕T 23710—2009所提供的方法測定。稱取干燥試樣0.1 g(精確至0.000 1 g)，置于100 ml容量瓶中，加入大約80 ml水，混合后，超聲提取30 min。靜止10 min，用水定容。離心，過0.45 μm濾膜，上機測定。采用外標(biāo)法測定。

2 討論

2.1 滴定法的不確定評價

2.1.1 數(shù)學(xué)模型

甜菜堿鹽酸鹽的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計算∶

式中：X——試樣中甜菜堿鹽酸鹽含量(%)；

c——高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度(mol∕l)；

V——滴定試樣時消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積(ml)；

V0——滴定空白時消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積(ml)；

m——試樣的質(zhì)量(g)；

0.015 36——與1.00 ml高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(HC1O4)=0.1 mol∕l]相當(dāng)?shù)?、以克表示的甜菜堿鹽酸鹽的質(zhì)量。

高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定的計算公式為：

式中：c——高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度(mol∕l)；

m——鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物質(zhì)量(g)；

P——鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物的純度(99.97%)；

V——高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(ml)；

M——鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量(g∕mol)。

2.1.2 滴定法測量不確定度的來源分析

根據(jù)含量計算公式，滴定法測定甜菜堿鹽酸鹽不確定度的來源主要有標(biāo)定高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c的不確定度、稱量樣品質(zhì)量m的不確定度、用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣品所消耗體積V與空白體積V0的不確定度。其中標(biāo)定高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度涉及因素較多，應(yīng)單獨討論。由于實驗室溫度基本保持一致，并且溫度的不確定度對實驗結(jié)果影響較小，可以忽略不計，本次不確定度評估過程忽略溫度的影響。

2.1.3 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液標(biāo)定過程及測量不確定度的評估

標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定過程的不確定度與基準(zhǔn)試劑的稱量m、純度P、標(biāo)定時消耗溶液的體積V、鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量M等影響因素有關(guān)。以某次標(biāo)定為例：稱樣0.706 1 g，標(biāo)定體積為34.12 ml，代入公式可得：

2.1.3.1 基準(zhǔn)試劑的稱量不確定度

干燥器與天平稱量器內(nèi)均放置同質(zhì)硅膠，視為相同濕度，稱量時無吸潮。電子天平檢定證書給出最大允差為0.000 1 g，按均勻分布，取包含因子k=，故稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.000 1 g∕3=0.000 058 g；因為稱量采用的是減量法，故稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)為：u(m)=×0.000 058=0.000 082 g。

2.1.3.2 鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物的摩爾質(zhì)量(M)的不確定度

鄰苯二甲酸氫鉀（KHP）的分子式為C8H5O4K。該分子的摩爾質(zhì)量的不確定度可以通過合成各組成元素原子量的不確定度得到。計算公式為：

2.1.3.3 純度P

采用基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀，其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書所給的純度為99.97%，擴展不確定度（k=2）為0.02%,則其純度的不確定度為：u(P)=0.02%∕2=0.01%=0.000 1。

2.1.3.4 滴定體積含量的不確定度

滴定過程借助于50 ml的酸式滴定管來完成，高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定的體積有三個同樣的不確定度來源：滴定體積終點的判斷、體積校準(zhǔn)時的不確定度以及由實驗室溫度與酸式滴定管校準(zhǔn)時溫度不一致而帶來的不確定度。

滴定使用50 ml酸式滴定管(A級)，按照檢定證書給出的最大允許誤差為±0.05 ml，假定為三角形分布，取包含因子k=，則量具本身引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.05∕6=0.020 4 ml；由于使用結(jié)晶紫指示劑肉眼判斷終點，根據(jù)CNAS—GL06：2006所述，肉眼判斷的標(biāo)準(zhǔn)不確定度大約為0.03 ml；則滴定管標(biāo)定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V)==0.036 3 ml。

2.1.3.5 標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的合成不確定度評定

按下式計算合成不確定度：

2.1.4 用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定樣品中甜菜堿含量的測量不確定度的評估

2.1.4.1 稱量樣品質(zhì)量引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

如前所述，樣品稱量引起的不確定度主要是分析天平校準(zhǔn)不確定度，稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)為：u(m)=0.000 082 g。

2.1.4.2 用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定甜菜堿樣品所消耗體積的不確定度

用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣品所消耗體積的不確定度，包括滴定樣品引起的不確定度和滴定空白引起的不確定度。根據(jù)本實驗的實際滴定情況，滴定空白時所消耗的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積幾乎為零，因此可以認(rèn)為滴定樣品時所消耗的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積與滴定空白時所消耗的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積之差的不確定度（V-V0）與滴定樣品引起的不確定度V相同。則滴定管的不確定度為u(V-V0)=0.036 3 ml。

2.1.4.3 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度引起的不確定度

高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度如上文所述，其不確定度為 uc(c)=0.000 16 mol∕l。

2.1.4.4 滴定法測定甜菜堿鹽酸鹽樣品的不確定度

以某次標(biāo)定為例：稱樣0.401 6 g，標(biāo)定體積為25.72 ml，代入公式可得：

因最終計算是取重復(fù)測量的兩個結(jié)果的算術(shù)平均值，根據(jù)JJF 1059-2012中合并樣品的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的規(guī)定：最終測量結(jié)果表示為0.157∕=0.11。

2.1.4.5 擴展不確定度

在有效自由度不確定的情況下，一般情況下擴展因子是k=-2，因此甜菜堿鹽酸鹽含量測定結(jié)果的擴展不確定度為：u(x)=uc(x)×2=0.22%，含量測定結(jié)果可表示為（99.65±0.22）%。

2.2 離子色譜法不確定度評價

2.2.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù) GB∕T 23710—2009，離子色譜法檢測甜菜堿鹽酸鹽含量，測定結(jié)果和有關(guān)參數(shù)有以下函數(shù)關(guān)系：

式中：c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣測試液中甜菜堿的濃度(mg∕ml)；

V——定容體積(ml)；

m——試樣的質(zhì)量(g)。

以某次測定為例：稱樣0.101 6 g，定容至100 ml，測定溶液中甜菜堿的濃度為0.750 9 mg∕ml，代入公式可得：

2.2.2 甜菜堿含量測量不確定度的來源分析

根據(jù)本項目檢測方法及數(shù)學(xué)模型，影響甜菜堿含量檢測的不確定度分量為3種：樣品質(zhì)量m不確定度、樣品稀釋體積V的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線查找濃度c的不確定度。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線查找濃度c的不確定度與標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程、標(biāo)準(zhǔn)工作液的稀釋、采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度有關(guān)。

2.2.3 測量不確定度評定

2.2.3.1 樣品質(zhì)量的不確定度

如上文所述稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)為：u(m)=0.000 082 g。

2.2.3.2 樣品稀釋引起的不確定度

在測量過程中，將稱量好的樣品溶液于100 ml容量瓶中，加水定容。100 ml容量瓶的允許誤差分別為±0.2 ml、按三角分布計；稀釋過程中引起的不確定度u(V)=0.2=0.081 6 ml。

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程產(chǎn)生的不確定度(見表1)

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程時產(chǎn)生的不確定度主要來自于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)固體稱量、定容等過程，它的準(zhǔn)確稱量直接關(guān)系到稀釋的各個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，甜菜堿純度標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.7%，相對不確定度為0.6%。在配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液過程中，標(biāo)準(zhǔn)品、天平稱量與100 ml容量瓶定容所產(chǎn)生的不確定度分別為 u(P)∕P=0.006，u(m)∕m=0.000 818 g和u(V)∕V=0.000 816 ml。標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為：

2.2.3.4 稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時產(chǎn)生的不確定度u(V)

使用標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行了4次稀釋，分別使用了1、5、25 ml的分度吸量管和50 ml的容量瓶。根據(jù)JJC 196要求，1、5、25 ml的分度吸量管和50 ml的容量瓶的最大允許誤差分別為±0.10 ml、±0.025 ml、±0.008 ml和±0.05 ml，假定為三角形分布(1)，取包含因子k=，分別得不確定度為0.040 8、0.010 2、0.003 26、0.020 4。

表1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的不確定度的計算

2.2.3.5 采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度過程中引入的不確定度

使用手工繪制的校準(zhǔn)曲線計算甜菜堿的量。用1 mg∕ml甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中配制五個標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg∕ml。并對其峰面積進(jìn)行測定，測定數(shù)據(jù)見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與檢測樣品測定的峰面積及擬合曲線值

由表2得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線方程：y=7.258 6x-0.017 5(r=0.999 8),取待測樣品溶液，平行測定2次、由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求的平均濃度c0=0.750 9 mg∕ml，參照文獻(xiàn)和JJC 2159，c0的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.3.6 離子色譜儀器自身的不確定度

因儀器所處狀態(tài)不同、噪音水平不同，同一試樣在離子色譜上的響應(yīng)值存在一定的差異。離子色譜儀自身的不確定度因各自儀器的不同而有所差距。根據(jù)離子色譜檢定證書的檢定數(shù)據(jù)，檢測所使用的離子色譜儀在k=2的情況下，離子色譜的擴展不確定度為1.5%，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果離子色譜儀器自身的不確定度為u(y)=0.75%=0.007 5。

2.2.4 合成不確定度

根據(jù)以上對各不確定度分量的評定結(jié)果，結(jié)合甜菜堿鹽酸鹽中甜菜堿鹽酸鹽含量的相對不確度數(shù)學(xué)模型，甜菜堿樣品中甜菜堿含量測定結(jié)果的相對合成不確定度計算結(jié)果如下：

因最終計算是取重復(fù)測量的兩個結(jié)果的算術(shù)平均值，根據(jù)JJF 1059—2012中合并樣品的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的規(guī)定：最終測量結(jié)果表示為2.07∕=1.46。

2.2.5 擴展不確定度

在有效自由度不確定的情況下，一般情況下擴展因子是k=2，因此離子色譜法含量測定結(jié)果的擴展不確定度u(x)=uc(x)×2=2.92%，含量測定結(jié)果可表示為(97.34±2.92)%。

3 總結(jié)

采用非水滴定法測定甜菜堿的含量，其測量不確定度來源于高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)性的標(biāo)定、滴定液消耗的體積和電子天平的不確定度。而影響其測量不確定度的最主要因素為標(biāo)定高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c的不確定度。因此，對高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定是檢測甜菜堿的關(guān)鍵控制點，在實驗過程應(yīng)加以重視，此外滴定液消耗的體積也是一個值得注意的控制點。

從計算結(jié)果可以看出，在離子色譜法測定甜菜堿含量的過程中，影響其測量不確定度的最主要因素為采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度過程中引入的不確定度、稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的時產(chǎn)生的不確定度、離子色譜儀器自身的不確定度。因此使用離子色譜法檢測過程中，離子色譜自身狀態(tài)和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配置是檢測的關(guān)鍵控制點。

從兩種方法的不確定度數(shù)據(jù)上來看：離子色譜法測定甜菜堿含量的不確定度為2.92%。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非水滴定法測定甜菜堿含量的不確定度0.22%。雖然離子色譜法可準(zhǔn)確鑒別的甜菜堿的真假，并準(zhǔn)確的測定飼料及復(fù)合預(yù)混料中甜菜堿的測定。但是離子色譜法能夠有效地測定甜菜堿的檢測誤差與非水滴定法高的多。因此，如果是對真正的飼料添加劑甜菜堿鹽酸鹽純品，建議可以使用離子色譜法來鑒別甜菜堿的真假；如果測得含量大于90%，可以使用非水滴定法準(zhǔn)確確定甜菜堿的含量。