響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶復(fù)合水解雞蛋全液

■賀 靜 劉春娥 于士翔 張辛豹 劉 峰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái) 264000）

雞蛋營(yíng)養(yǎng)豐富，幾乎包含了一個(gè)胚胎發(fā)育所需的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。雞蛋中蛋清蛋白包含卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白、類卵黏蛋白、溶菌酶、球蛋白等，其約占蛋清質(zhì)量的10%～12%[1]。研究表明，蛋清蛋白中含有人體所必需的多種氨基酸，且組成比例合適，其營(yíng)養(yǎng)成分和分子結(jié)構(gòu)與人體血漿白蛋白十分相似，因此具有極強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)和保健作用，是一種理想的蛋白質(zhì)資源[2-3]，同時(shí)也是畜禽鈣、磷的良好來(lái)源之一[4]。隨著人們對(duì)雞蛋營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的認(rèn)識(shí)，雞蛋市場(chǎng)逐漸擴(kuò)大，家禽養(yǎng)殖的規(guī)模越來(lái)越大，從小農(nóng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展到龐大的家禽養(yǎng)殖業(yè)，我國(guó)成為了禽蛋生產(chǎn)第一大國(guó)[5]，約占世界總產(chǎn)量的1∕3。但是，在養(yǎng)殖過(guò)程中工作人員操作的失誤、母雞對(duì)雞蛋的踩踏、運(yùn)輸過(guò)程中的碰撞以及長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存導(dǎo)致的變質(zhì)，使得部分雞蛋無(wú)法食用；此外，由于雞蛋蛋清蛋白中含有過(guò)敏性蛋白、蛋白抑制因子等物質(zhì)，加熱易凝固、熱穩(wěn)定性較差等問(wèn)題，在一些食品的加工中，蛋清被舍棄，不僅造成浪費(fèi)并且污染環(huán)境[6]。因此，通過(guò)蛋白酶酶解的方式，將破損雞蛋蛋液中豐富的蛋白質(zhì)水解為更加容易被吸收的小分子多肽及氨基酸添加劑，不僅廢物利用，而且極大的提高了蛋白質(zhì)的吸收率，減少過(guò)敏性，改善其溶解性、乳化性、氣泡性、持水性等功能特性[7]。

許旖旎等[3]采用FlavourLym在底物濃度3%，酶濃度0.2%，溫度50℃,pH值6.0，水解時(shí)間7 h的條件下，獲得穩(wěn)定性和風(fēng)味較好的半透明雞蛋酶解液，水解率達(dá)到45%。周利亙等[8]通過(guò)單因子試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定中性蛋白酶水解制備蛋清蛋白肽的最佳工藝條件，氮回收率最高達(dá)到49.22%。熊學(xué)斌等[9]利用木瓜蛋白酶酶解制備雞蛋全粉的最佳工藝為酶解溫度55℃，酶解時(shí)間3 h，酶解pH值4.5，酶用量0.6%，在該條件下，新鮮雞蛋液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.160%。

不同的酶具有不同的生物活性成分，作用的肽鍵也不相同，這取決于酶的活性位點(diǎn)[10]。通過(guò)對(duì)木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶四種蛋白酶進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)水解效果及pH值選擇堿性蛋白酶和中性蛋白酶雙酶復(fù)合。復(fù)合酶水解不僅能達(dá)到相互補(bǔ)充，提高酶解效果，增加氨基酸含量[5]，而且可有效水解苦味肽，減輕甚至消除苦味，獲得苦味值低、溶解性好的蛋白水解產(chǎn)物[9，11]。

本試驗(yàn)以雞蛋全液為原料，采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合，運(yùn)用響應(yīng)面分析方法，制備氨基酸含量高且風(fēng)味良好的飼料添加劑，為廢棄雞蛋的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雞蛋全蛋液(購(gòu)自超市鮮雞蛋）。

1.2 儀器與試劑

HCl、NaOH、堿性蛋白酶（≥200 000 U∕g，北京索萊寶科技有限公司）、中性蛋白酶（60 000 U∕g，北京索萊寶科技有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)(TDL-50B，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、紫外分光光度計(jì)(TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)等。

1.3 試驗(yàn)流程

新鮮雞蛋全蛋液→勻漿→加水調(diào)節(jié)料液比→調(diào)節(jié)pH值→加酶→恒溫水解→離心→茚三酮比色。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取200 mg甘氨酸（純度≥99%），溶于100 ml水中，即母液。用此母液及磷酸緩沖液配制終質(zhì)量濃度分別為 0、20、40、60、80、100、150 μg∕ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液4 ml，加入1.0 ml 1.2%茚三酮溶液、1.0 ml磷酸緩沖液（pH值8.04），水浴加熱15 min，冷卻至常溫后加水定容至25 ml，于568 nm處測(cè)定吸光度，以試劑空白為空白對(duì)照測(cè)定其他溶液的吸光度，繪制甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 雙酶復(fù)合單因素試驗(yàn)

利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶作為復(fù)合水解酶，以氨基酸含量為指標(biāo)，研究復(fù)合酶的加酶量、料液比、以及酶解時(shí)間對(duì)全蛋液水解的影響。

1.4.2.1 時(shí)間對(duì)氨基酸含量的影響

將全蛋液pH值調(diào)至為6.8，料液比為1∶1，堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比為1∶1，加酶量10%，分別在55 ℃酶解2、4、6、8、10 h，以氨基酸含量為評(píng)定指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2.2 加酶量對(duì)氨基酸含量的影響

將全蛋液pH值調(diào)至為6.8，料液比為1∶1，堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比為1∶1，在55℃酶解8 h，將加酶量分別設(shè)定為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，以氨基酸含量為評(píng)定指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2.3 料液比對(duì)氨基酸含量的影響

將全蛋液pH值調(diào)至為6.8，堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比為1∶1,酶加量10%，在55℃下酶解8 h，將料液比分別設(shè)定為1∶5、3∶5、1∶1、5∶3，以氨基酸含量為評(píng)定指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.3 雙酶復(fù)合響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選擇料液比、加酶量以及酶解時(shí)間三個(gè)因素，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，具體試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.4.1節(jié)介紹的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法得到甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)氨基酸含量的影響(見(jiàn)圖2)

如圖2a所示，隨著料液比的增大，在一定范圍內(nèi)，酶解液中氨基酸含量逐漸增加。當(dāng)料液比為1∶3時(shí)，氨基酸含量達(dá)到最大值。料液比通過(guò)影響底物濃度繼而影響酶與底物的結(jié)合，在底物濃度低時(shí)，溶質(zhì)的流動(dòng)性好，酶與底物結(jié)合充分，酶解液中氨基酸含量不斷增加；隨底物濃度的提高，溶質(zhì)的流動(dòng)性變差，酶與底物不能充分結(jié)合，限制了反應(yīng)的進(jìn)行[12]。

2.2.2 加酶量對(duì)氨基酸含量的影響

如圖2b所示，隨著加酶量的增加，氨基酸含量不斷上升，當(dāng)加酶量達(dá)到1.0%時(shí)，氨基酸含量趨于平緩。這是由于底物濃度相同，酶達(dá)到一定濃度后，底物完全被酶解，因此氨基酸含量變化不大。

2.2.3 時(shí)間對(duì)氨基酸含量的影響

如圖2c所示，隨著水解時(shí)間的增長(zhǎng)，氨基酸含量不斷增加，在8 h時(shí)，酶解液中氨基酸含量趨于平緩。一是酶解前期酶活力高，產(chǎn)物的抑制作用小，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸下降，產(chǎn)物增多、抑制作用加強(qiáng)。有文獻(xiàn)表明，抑制劑通常為短肽,因此酶解后期酶解液中氨基酸含量變化不大[12-13]；二是可能酶解液的底物酶解完全，基本轉(zhuǎn)換成氨基酸，在底物濃度相同的情況下，酶解液的氨基酸含量相差不大。

圖2 單因素試驗(yàn)對(duì)氨基酸含量的影響（a料液比；b加酶量c酶解時(shí)間）

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

采用中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)雙酶水解全蛋液的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化(見(jiàn)表2)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到全蛋液酶解液中氨基酸含量(DH)與酶解時(shí)間(A)、加酶量(B)、料液比(C)3個(gè)因素在編碼空間的多元回歸方程∶

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

氨基酸含量(mg∕ml)=2.08+0.078A+0.14B+0.3C+0.021AB+0.037AC-0.12BC-0.44A2-0.12B2-0.37C2(ABC是編碼制）。

通過(guò)表3列出的響應(yīng)面回歸方程的方差分析結(jié)果，模型的P值小于0.05，說(shuō)明模型因素水平項(xiàng)總體上顯著，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了雙酶水解全蛋液的氨基酸含量與酶解時(shí)間、料液比、加酶量之間的關(guān)系。綜合以上各參數(shù)，證明各因素水平區(qū)間設(shè)計(jì)合理，該試驗(yàn)方法可靠，可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析結(jié)果

為研究3個(gè)因素的變化與氨基酸含量之間的關(guān)系，固定一個(gè)因素不變,分析另外兩因素對(duì)酶解過(guò)程的相互作用，繪制三維響應(yīng)面圖和等高線圖（圖a、b、c）具體分析三因素(A酶解時(shí)間，B加酶量，C料液比)的交互效應(yīng)。從而可直觀、快速地找到最佳參數(shù)，參數(shù)之間的相互作用以及最大的響應(yīng)值[14]。

由圖3a可見(jiàn)，酶解時(shí)間保持一定，隨著料液比的升高，氨基酸含量先升高后降低。加酶量升高，氨基酸含量先升高后趨于平緩。從等高線圖中可看出，料液比低時(shí)的等高線較密，說(shuō)明在料液比較低的一定范圍內(nèi)對(duì)氨基酸含量的影響較大。隨著加酶量升高，等高線逐漸變寬，說(shuō)明對(duì)氨基酸含量影響較小。

由圖3b可見(jiàn)，加酶量保持一定，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸含量先升高后降低。隨著料液比的增加，氨基酸含量變化先增加后降低。料液比影響底物濃度，底物濃度逐漸增加，氨基酸含量上升，當(dāng)料液比達(dá)到一定限度時(shí)，溶質(zhì)流動(dòng)性降低，不能與酶充分結(jié)合，氨基酸含量降低。

由圖3c可見(jiàn)，料液比保持一定，加酶量的變化平緩，對(duì)氨基酸含量影響不顯著，而酶解時(shí)間的變化對(duì)氨基酸含量的影響較大，通過(guò)等高線圖，可以看出，隨著加酶量、酶解時(shí)間的升高，等高線逐漸稀疏，影響逐漸降低。

試驗(yàn)結(jié)果表明在中心點(diǎn)附近具有最大的響應(yīng)值?；貧w方程的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示最佳的酶解條件是：酶解時(shí)間6.67 h，料液比1.13∶1，加酶量1.1%。在此條件下，氨基酸的預(yù)測(cè)濃度為2.171 mg∕ml。

圖3 響應(yīng)面分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)分析，確定堿性蛋白酶和中性蛋白酶雙酶水解全蛋液的最佳工藝條件，在此條件下酶解物中氨基酸含量達(dá)到2.171 mg∕ml。蛋白酶水解有利于蛋液中功能性成分的保護(hù)，且酶解液中的蛋清蛋白等大分子降解成易吸收的低分子生物活性物質(zhì)[6]，大部分苦味氨基酸被轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，增加了酶解液中的風(fēng)味物質(zhì)，具有特殊的發(fā)酵香味和保健功能[14-15]，作為飼料添加劑有利于動(dòng)物的攝食與營(yíng)養(yǎng)吸收。