枸杞鮮花總多酚抗氧化性研究

■張 欣 貝盞臨喬亞飛

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021)

寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)，系茄科(Solanace?ae)枸杞屬(Lycium L.)多年生落葉灌木，是唯一被載入《中國(guó)藥典》的枸杞藥用品種。枸杞全身是寶，《本草綱目》記載“春采枸杞葉，名天精草；夏采花，名長(zhǎng)生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。大量研究結(jié)果表明，植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)重要的多元酚類次生代謝物質(zhì)，具有吸收過(guò)多的太陽(yáng)輻射、過(guò)濾UV(Ultra-Violet)和清除體內(nèi)自由基等多種生理功能。隨著植物多酚類成分在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗微生物、調(diào)血脂和血糖等多方面活性的發(fā)現(xiàn)和闡明，植物多酚具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化活性、抗衰老等生物活性功能，現(xiàn)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。本文優(yōu)化出枸杞鮮花多酚最佳提取方法，并進(jìn)行體外DPPH的清除率、FRAP、對(duì)ABTS+的清除率、對(duì)的清除率等抗氧化能力研究，為今后枸杞鮮花鮮食等應(yīng)用研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

枸杞鮮花，采集自寧夏銀川市郊區(qū)銀川育新枸杞種業(yè)有限公司枸杞種植地（東經(jīng)106°5′19.07″，北緯38°30′32.98″）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 確定影響提取率的因素及水平

采用微波提取法，以提取溶劑乙醇的濃度、提取時(shí)間、提取功率為試驗(yàn)的主要影響因素，見(jiàn)表1。

表1 單因素水平試驗(yàn)方案

1.2.2 多酚提取步驟

稱取枸杞鮮花1.0 g，放入預(yù)冷的研缽中加液氮進(jìn)行快速研磨成勻漿，并相應(yīng)加入70 ml不同濃度的乙醇溶液，于不同微波提取時(shí)間、微波提取功率等條件下提取。待提取完成，將提取液冷卻過(guò)濾、用蒸餾水定容至50 ml。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定

參照程劉柯等方法測(cè)定多酚含量。

1.2.4 單因素水平試驗(yàn)

1.2.4.1 提取時(shí)間

提取功率為50 W，提取液濃度為60%，以提取時(shí)間為變量。方法按1.2.2進(jìn)行。

1.2.4.2 提取功率

提取時(shí)間為100 s，提取液濃度為60%，以提取功率為變量。方法按1.2.2進(jìn)行。

1.2.4.3 提取液濃度

提取功率為80 W，提取時(shí)間100 s，以提取液濃度為變量。方法按1.2.2進(jìn)行。

1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)計(jì)算

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)Design-Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，對(duì)影響枸杞鮮花多酚提取率的提取時(shí)間、提取功率、溶劑濃度的三因素五水平進(jìn)行試驗(yàn)分析。

1.4 抗氧化活性評(píng)價(jià)

用下列四種方法對(duì)最優(yōu)條件下提取的枸杞鮮花乙醇水提物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)：DPPH、ABTS+和FRAP、。

1.4.1 ABTS+法

ABTS+法根據(jù)米勒（1993）方法稍有改動(dòng)。配制濃度為 7 mmol∕l ABTS+和 4.9 mmol∕l過(guò)硫酸鉀的母液,等體積混合，室溫，避光條件下靜置12～16 h，制得ABTS+自由基儲(chǔ)存液，使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.7±0.02的應(yīng)用液。取300 μl的枸杞鮮花提取液，加入3 ml ABTS應(yīng)用液，充分混合，空白用無(wú)水乙醇代替樣品液，室溫下避光反應(yīng)30 min后測(cè)定其在734 nm處的吸光度（無(wú)水乙醇空白）。以樣品對(duì)ABTS+自由基的清除率來(lái)表示各抗氧化劑的抗氧化能力。

ABTS+清除率(%)=(l-A樣品∕A對(duì)照)×100。

式中：A樣品——樣品管的吸光值；

A對(duì)照——對(duì)照管的吸光值。

1.4.2 DPPH法

DPPH（2,2-dyphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基的清除方法依據(jù)Blois（1958）方法稍有改動(dòng)。用無(wú)水乙醇配置濃度為500 μmol∕l的DPPH溶液。分別吸取0、40、80、120、140 μl的枸杞鮮花提取液∕抗壞血酸加入試管，分別加入1 ml DPPH，無(wú)水乙醇定容至5 ml。常溫暗置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度并作抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

DPPH自由基清除率(%)=[l-(Ai-Aj)∕A0]×100。

式中：Ai——(DPPH+樣品)反應(yīng)前的吸光度；

Aj——(DPPH+樣品)反應(yīng)30 min后的吸光度；

A0——(DPPH+乙醇)的吸光度。

1.4.3 三價(jià)鐵還原能力（FRAP）檢測(cè)

采用FRAP法測(cè)定枸杞鮮花提取物鐵還原力，在593 nm處測(cè)定其吸光度值，獲得線性方程y=0.000 7x+0.000 5(R2=0.997 8)。以FeSO4溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照，測(cè)得樣品的提取物的FRAP值為497.9∕μl。

將0.5 ml∕l的檸檬酸鹽緩沖液（pH值3.0）5.0 ml加入試管，加入1 ml 0.01%的NaNO2溶液，加枸杞鮮花乙醇水提取物500 μl，37℃水浴1 h。取此反應(yīng)液1 ml加入干凈的試管，并加入0.4%的對(duì)氨基苯磺酸溶液2 ml和0.2%鹽酸α-萘胺1 ml，搖勻放置15 min后，用分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)吸光度值，按下式計(jì)算清除率：

清除率(%)=(B0-B)∕B0×100。

式中：B0——未加樣品溶液的空白試驗(yàn)（以超純水代替）的吸光值；

B——不同濃度反應(yīng)液的吸光值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)均是重復(fù)三次，并計(jì)算平均值，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖1）

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，獲得多酚含量標(biāo)品的曲線方程為：y=0.617 5x+0.014 3；R2=0.994 1。圖1表明，隨著提取時(shí)間的增加，沒(méi)食子酸的提取率先增加，此后隨著提取時(shí)間的增加，提取率降低，并在100 s時(shí)提取率達(dá)到最大0.048%；微波功率的增加，沒(méi)食子酸的提取率先增加，然后降低，并在50 W時(shí)提取率達(dá)到最大0.043%；隨著乙醇提取液濃度的增加，沒(méi)食子酸的提取率先增加，然后降低，并在60%時(shí)提取率達(dá)到最大0.044%。

圖1 提取時(shí)間、提取功率、提取液乙醇濃度對(duì)枸杞鮮花總多酚提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert軟件進(jìn)行曲面響應(yīng)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

時(shí)間（t）、功率（W）、提取液乙醇濃度（c）變換為：A=t∕40-2.5，B=W∕25-3，C=c∕15-17∕3(t為實(shí)際提取時(shí)間，W為實(shí)際提取功率，c為實(shí)際提取液乙醇濃度)，以3次單因素試驗(yàn)所得的沒(méi)食子酸提取率的平均值為響應(yīng)值，結(jié)果見(jiàn)表3。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

結(jié)果表明，微波法提取枸杞鮮花沒(méi)食子酸的最佳工藝條件為乙醇濃度78.6%，提取時(shí)間149 s，提取功率63.2 W，提取得率為0.057 4%。通過(guò)分析我們知道，單因素的情況下，時(shí)間的最高提取率為0.048%，功率的最高提取率為0.043%，濃度的最高提取率為0.044%。沒(méi)有一個(gè)單因素的提取率高過(guò)理論值。采用Design-Expert對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程：

提取率(%)=0.053-4.80×10-3×A-5.18×10-3×B-1.38×10-3×C-1.96×10-3×A2-5.49×10-3×B2-1.61×10-3×C2。

表2 響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)

表3 響應(yīng)面分析方案

圖2 枸杞鮮花總多酚提取時(shí)間與提取功率響應(yīng)面與等高線

圖3 枸杞鮮花總多酚提取功率與溶劑濃度響應(yīng)面與等高線

圖4 枸杞鮮花總多酚提取時(shí)間與溶劑濃度響應(yīng)面與等高線

由表4可知，模型的擬合度顯著性為極顯著，回歸方程與試驗(yàn)擬合程度較好。各因素的顯著程度表明了因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，其中提取功率顯著，說(shuō)明提取功率對(duì)試驗(yàn)得率影響顯著。從F值分析，對(duì)提取率的影響：提取功率＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。微波能使水或物質(zhì)吸收微波而自發(fā)熱，實(shí)現(xiàn)“體加熱”。微波輻照會(huì)在非均質(zhì)固體內(nèi)部產(chǎn)生應(yīng)力，起到破碎從而增大比表面積的作用。實(shí)際中的微波萃取原理，就是利用微波能來(lái)提高萃取率的一種新技術(shù)。

表4 枸杞鮮花沒(méi)食子酸提取率回歸分析結(jié)果

2.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)

目前，有多種方法測(cè)定抗氧化活性，但大多數(shù)是針對(duì)物質(zhì)清除某一種自由基而言，并不能反映出其總的抗氧化能力，因?yàn)槲镔|(zhì)總的抗氧化能力是物質(zhì)清除不同的自由基或者是物質(zhì)的不同活性成分、清除不同的自由基的有效和，鑒于物質(zhì)在生物體內(nèi)起作用的正是其總的抗氧化能力，因此用總的抗氧化能力(total anti-oxidant activity,TAA)來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力是很有必要的。

2.3.1 DPPH法

測(cè)定枸杞鮮花最優(yōu)工藝提取物清除DPPH的能力，以抗壞血酸(VC)作陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定結(jié)果顯示(圖5)，兩者清除DPPH的能力隨著濃度的增加而增強(qiáng).且在圖示范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。樣品對(duì)DPPH的 IC50值是 1.470 1 mg∕l，VC 對(duì) DPPH 的 IC50值是0.072 2 mg∕l。

表明枸杞鮮花提取液是一類較強(qiáng)的自由基消除劑，可能與其含有具自由基清除活性的多酚類化合物有關(guān)。

圖5 樣品、VC對(duì)DPPH清除率

2.3.2 FRAP法

采用FRAP法測(cè)定枸杞鮮花最優(yōu)工藝提取物總還原力，測(cè)定結(jié)果顯示，F(xiàn)eSO4溶液的濃度在200～100 0 μmol∕l與FRAP工作液反應(yīng)，在波長(zhǎng)為 593 nm處的吸光度呈線性關(guān)系。線性方程為：y=0.000 7x+0.000 5(R2=0.997 8)。以FeSO4溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照，測(cè)得樣品的提取物的FRAP值為497.9∕μl。

枸杞鮮花提取液為良好的電子供應(yīng)者,它們所提供的電子可使Fe3+還原為Fe2+,說(shuō)明枸杞鮮花具有抗氧化潛力,可用于開(kāi)發(fā)抗氧化功能食品。

2.3.3 ABTS+法

測(cè)定枸杞鮮花最優(yōu)工藝提取物清除ABTS+的清除能力（圖6），ABTS+的OD734nm值在濃度40～350 μg∕l的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，當(dāng)超過(guò)該范圍時(shí)就趨于穩(wěn)定，并在波長(zhǎng)為734 nm處有最大OD值，當(dāng)還原性物質(zhì)的含量再增加時(shí)就不再呈現(xiàn)線性關(guān)系。線性方程為：y=272.594 0x+1.305 0(R2=0.991 4)。當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)，樣品的濃度為0.178 6 mg∕l。

3 結(jié)論

寧夏枸杞是枸杞中唯一被納入中國(guó)藥典的枸杞種，枸杞為無(wú)限花序，每一茬的結(jié)果中都會(huì)有一大批花的掉落，這無(wú)疑是一種損失，如果能將沒(méi)有結(jié)果的花加以利用，無(wú)疑將增加枸杞的“深加工鏈”。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，枸杞鮮花提取液對(duì)DPPH、ABTS+、的IC50值分別是1.470 1、0.178 6 mg∕l和 0.413 3 mg∕l，而VC對(duì)DPPH的IC50值是0.072 2 mg∕l；IC50值越低表示更高的自由基清除能力，即枸杞鮮花多酚提取物對(duì)ABTS的清除率＞對(duì)的清除率＞對(duì)DPPH的清除率，但VC對(duì)DPPH的IC50值遠(yuǎn)小于樣品對(duì)DPPH的值，說(shuō)明VC對(duì)DPPH具有更強(qiáng)的清除能力。FRAP法在593 nm處測(cè)定的總還原力表明，枸杞鮮花多酚提取物的FRAP值為497.9∕μl。

圖6 樣品對(duì)ABTS+、清除率

有關(guān)枸杞花方面的研究，目前主要集中在枸杞的干花中的多糖、黃酮、多酚、色素等含量的提取及測(cè)定，另外也對(duì)枸杞干花進(jìn)行了抗氧化活性的研究。枸杞干花和鮮花中的多酚和黃酮均有較好的抗氧化作用。通過(guò)比較枸杞干花和鮮花中多酚含量可看出，枸杞干花、鮮花多酚含量分別為1.49%、0.055%，均顯示出較好的抗氧化性能，如果對(duì)其加以利用，可達(dá)到“變廢為寶”的效果。

枸杞鮮花中的總多酚提取物具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，枸杞鮮花總酚和總黃酮含量與其抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，因此，可將其作為抗氧化添加劑的一個(gè)重要來(lái)源，作為高抗氧化作用的食品或保健品進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

（參考文獻(xiàn)刊略，需者可函索zhangxin-weiyi8866@126.com）