pH對(duì)小麥HMW-GS 1Dx5的N端結(jié)構(gòu)域分子特性的影響*

胡松青 張亞萍 王敬敬 劉光毅 黃滟波， 李琳 侯軼

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.華南理工大學(xué) 廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510640; 3.華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510640)

pH對(duì)小麥HMW-GS 1Dx5的N端結(jié)構(gòu)域分子特性的影響*

胡松青1，2張亞萍1王敬敬1劉光毅1黃滟波1，3李琳1，2侯軼3

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.華南理工大學(xué) 廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510640; 3.華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510640)

采用內(nèi)源熒光光譜、總自由巰基定量、非還原和還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以及原子力顯微鏡(AFM)等方法探究了pH值對(duì)高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)1Dx5的N端結(jié)構(gòu)域(1Dx5-N)聚集體形成的影響規(guī)律.結(jié)果顯示:與酸性和堿性條件下相比，中性(pH=7.0)條件下，1Dx5-N的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了藍(lán)移，表明中性條件下1Dx5-N聚集程度增加；與酸性和堿性處理?xiàng)l件相比，中性條件下1Dx5-N的總自由巰基含量降低，且形成了更多的二聚體和高聚體，表明中性環(huán)境更有利于1Dx5-N的聚集，且分子間二硫鍵對(duì)聚集體的形成發(fā)揮了重要作用；中性條件下形成了顆粒直徑相對(duì)較大的聚集體，進(jìn)一步證明了中性條件更有利于1Dx5-N的聚集.從而從分子層面證明了中性條件下進(jìn)行面制品加工的合理性.

高分子量麥谷蛋白亞基；N端結(jié)構(gòu)域；聚集體

小麥?zhǔn)悄壳笆澜缟献钪匾霓r(nóng)作物之一，小麥中含有的面筋蛋白賦予了面團(tuán)獨(dú)特的性質(zhì)，進(jìn)而滿足不同質(zhì)地、不同形狀面制品(如面條、面包、饅頭等)的加工需要[1- 2].小麥面筋蛋白主要由麥谷蛋白和醇溶蛋白組成，其中高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)是麥谷蛋白的重要組成成分.HMW-GS的相對(duì)分子質(zhì)量范圍為68 000～89 000，其氨基酸序列可分為3個(gè)區(qū)域，分別為非重復(fù)的N-末端區(qū)、C-末端區(qū)和高度重復(fù)的中間區(qū)[3- 5].盡管 HMW-GS 在小麥面筋蛋白中占的比例不大(約占10%)，但由于其賦予了小麥面筋彈性，因此在很大程度上決定著面制品的加工品質(zhì)[5- 6].

由于面筋蛋白分子鏈上存在著自由氨基和羧基，這些基團(tuán)能在溶液中發(fā)生酸性電離或堿性電離，進(jìn)而改變面筋蛋白基團(tuán)的性質(zhì)，因此pH值的改變可能會(huì)影響以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)形成的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[7].Doguchi等[8]研究了酸性條件下生面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)，結(jié)果顯示pH在4.5～6.0范圍內(nèi)，面團(tuán)強(qiáng)度呈現(xiàn)線性增加趨勢(shì).同時(shí)，Holmes等[9]研究了pH對(duì)面包烘焙品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)pH在4.65～6.15范圍內(nèi)時(shí)，面包的烘焙體積增加，而在更高pH值條件下面包體積則明顯下降.以上結(jié)果充分表明，pH值具有影響面團(tuán)強(qiáng)度以及面制品加工品質(zhì)的能力.

研究已經(jīng)證明，面團(tuán)和面制品品質(zhì)與面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，在面筋網(wǎng)絡(luò)的形成中，高分子量麥谷蛋白亞基通過(guò)分子間二硫鍵“頭尾相連”的方式構(gòu)成骨架結(jié)構(gòu)，而HMW-GS的N端結(jié)構(gòu)域是半胱氨酸的集中區(qū)，半胱氨酸是形成二硫鍵的反應(yīng)位點(diǎn)，這是形成彈性骨架的重要結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)[10- 13].另外，研究表明，在HMW-GS的不同種類的亞基中，同時(shí)含有亞基1Dx5和1Dy10的面筋蛋白對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響最為顯著，且當(dāng)單獨(dú)添加1Dx5或1Dy10到面粉中時(shí)，1Dx5在增強(qiáng)面團(tuán)強(qiáng)度上效果更加明顯[13- 14]，因此，選擇1Dx5-N為研究對(duì)象，既具有HMW-GS的N-末端結(jié)構(gòu)域的普遍意義，又有優(yōu)質(zhì)亞基的獨(dú)特性.

筆者所在課題組已經(jīng)成功克隆并表達(dá)出高分子量麥谷蛋白亞基1Dx5的N端結(jié)構(gòu)域(1Dx5-N)，并研究了1Dx5-N的溶解性以及鹽離子對(duì)其聚集行為的影響[15].因此，文中在前期研究基礎(chǔ)之上，旨在通過(guò)研究不同pH條件下1Dx5-N聚集行為的變化，從分子層面揭示pH值對(duì)面制品加工品質(zhì)的影響情況.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1Dx5-N由筆者所在實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)，其中構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒為pET-30b，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)菌株為E.coliBL21(DE3)[15].

1.2 儀器與設(shè)備

鎳離子親和層析柱(預(yù)裝柱)，26/10 Desalting脫鹽柱(預(yù)裝柱)，美國(guó)GE公司生產(chǎn)；3 ku超濾管，美國(guó)菲博生物科技有限公司生產(chǎn)；F-7000型熒光光譜儀，HITACHI公司生產(chǎn)；MuLtiMode SPM原子力顯微鏡，美國(guó)Veeco公司生產(chǎn)；Sunrise 酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司生產(chǎn)；Brion 3 STAR精密pH計(jì)，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 1Dx5-N的表達(dá)和純化

以亞基1Dx5的全長(zhǎng)基因組序列為模板，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼1Dx5-N的目的基因，以pET-30b質(zhì)粒為載體構(gòu)建1Dx5-N重組表達(dá)質(zhì)粒[15].構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30b-1Dx5-N轉(zhuǎn)入宿主菌E.coliBL21(DE3)中，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，其中誘導(dǎo)劑IPTG 終濃度為0.5 mmol/L.離心收集菌體，0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.0)重懸菌體，冰浴下超聲破碎(超聲功率300 W，超聲頻率50 Hz，占空比0.4∶0.6).將破碎液于4 ℃、8 000 r/min下離心30 min，收集上清液，經(jīng)微濾后(0.22 μm)用于層析上樣.

應(yīng)用鎳離子親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定.對(duì)收集得到的目的蛋白使用脫鹽柱脫鹽，脫鹽緩沖液為20 mmol/L的磷酸鹽溶液(pH=7.0).然后，于4 ℃、4 500 r/min下對(duì)目的蛋白進(jìn)行濃縮，采用紫外光譜法測(cè)定其濃度，液氮速凍后保存在-80 ℃下備用[16].

1.3.2 等電點(diǎn)(PI)的測(cè)定

使用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)將1Dx5-N稀釋至0.1 g/L，測(cè)定pH值在2.5～7.5區(qū)間內(nèi)的Zeta電位變化.當(dāng)Zeta電位為零時(shí)的pH值即為樣品的等電點(diǎn).

1.3.3 內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

將1Dx5-N溶液pH值分別調(diào)節(jié)至3.5、7.0、7.6、8.2、9.4、10.2和11.0，最終質(zhì)量濃度為0.4 g/L，測(cè)定不同pH值對(duì)1Dx5-N的內(nèi)源熒光光譜影響.激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，測(cè)定300～400 nm發(fā)射波長(zhǎng)范圍內(nèi)樣品的熒光發(fā)射圖譜.1.3.4 總自由巰基含量的測(cè)定

將1Dx5-N溶液pH值分別調(diào)節(jié)至3.0、7.0和10.0，終質(zhì)量濃度為1.0 g/L，參照Z(yǔ)hao等[17]的方法進(jìn)行總自由巰基含量測(cè)定.取50 μL的蛋白樣品，依次加入150 μL 三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸稀釋緩沖液(86 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷、90 mmol/L 甘氨酸，4 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS、8 mol/L 尿素，pH=8.0)、100 μL 5,5′-二巰基(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)液(4 mg/L,pH=8.0)混合均勻，25 ℃放置15 min后在6 000 r/min下室溫離心1 min.吸取100 μL上清液置于96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定412 nm處的吸光度值，以還原型谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本吸光度值轉(zhuǎn)換為總自由巰基含量.

1.3.5 非還原SDS-PAGE和還原SDS-PAGE分析

使用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)將1Dx5-N稀釋至1 g/L，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、7.0和10.0，配置3%的濃縮膠和12%的分離膠，參照Z(yǔ)hao等[18]的方法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行非還原SDS-PAGE和還原SDS-PAGE分析.

1.3.6 原子力顯微鏡(AFM)觀察

調(diào)節(jié)1Dx5-N溶液pH值至3.0、7.0和10.0，蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/L.吸取3 μL蛋白溶液滴在新剝離的云母片上，室溫下干燥30 min，采用原子力顯微鏡(探針Scanasyst-Air)的輕敲模式室溫下(25±2)℃觀察每個(gè)pH值下的蛋白形貌.

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 1Dx5-N等電點(diǎn)分析

圖1為1Dx5-N的Zeta電位隨pH值的變化曲線.從圖中可以看出，當(dāng)pH值從2.5升高至4.0時(shí)，Zeta電位值相對(duì)恒定，隨著pH值的繼續(xù)增加，Zeta電位迅速下降；當(dāng)pH值上升到5.0時(shí)，Zeta電位降為零；當(dāng)pH值達(dá)到6.0后，Zeta電位變化又恢復(fù)平穩(wěn).因此，1Dx5-N的等電點(diǎn)pI=5.0.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)pH值位于其等電點(diǎn)附近(pH=4.0～6.0)時(shí)，其表面電荷下降，分子間靜電排斥力降低，容易形成沉淀[19]，為了排除沉淀對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，后續(xù)研究中不選擇此段pH值進(jìn)行測(cè)試.

圖1 重組1Dx5-N的Zeta電位曲線

2.2 pH對(duì)1Dx5-N內(nèi)源熒光光譜的影響

圖2 放置54 h后不同pH值1Dx5-N的內(nèi)源熒光光譜圖

Fig.2 Fluorescence spectrum of 1Dx5-N at different pH values at 54 h

2.3 pH對(duì)1Dx5-N二硫鍵形成的影響

為了更全面地闡述pH值對(duì)1Dx5-N蛋白質(zhì)分子聚集的影響，分別選擇酸性條件(pH=3.0)、堿性條件(pH=10.0)和中性條件(pH=7.0)下的1Dx5-N蛋白質(zhì)分子進(jìn)行研究.圖3為1Dx5-N在不同pH值條件下，總自由巰基含量隨放置時(shí)間的變化曲線.從圖中可以看出，1Dx5-N的總自由巰基含量在酸性條件下最高，堿性條件下次之，中性條件下最低；隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，不同pH條件處理下的1Dx5-N

圖3 不同處理時(shí)間和pH值下1Dx5-N的總自由巰基含量變化

Fig.3 Change of total free thiol group content in 1Dx5-N at different time and pH values

總自由巰基含量不斷降低.放置0 h時(shí)，1Dx5-N在pH=7.0,10.0和3.0條件下的總自由巰基含量分別為171.2±3.6、176.8±1.8、186.5±3.2 μmol/L,放置24 h后，總自由巰基含量相對(duì)0 h時(shí)分別降低了32.7%、18.6%和12.3%；放置時(shí)間達(dá)到54 h時(shí)，1Dx5-N的總自由巰基含量相對(duì)0 h時(shí)分別降低了46.8%、31.8%和21.5%.

同時(shí)，從非還原SDS-PAGE分析(見(jiàn)圖4)可以看出，1Dx5-N的存在形式有單體、二聚體和高聚體，對(duì)于放置0 h下的目的蛋白主要以單體和少量二聚體、高聚體形式存在；隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)(0～54 h)，單體逐漸減少，二聚體和高聚體逐漸增加，且中性條件下這種變化更快，當(dāng)放置24 h后，中性條件下的單體條帶已基本消失，放置54 h后，其單體條帶已經(jīng)消失不見(jiàn)；另外，從還原SDS-PAGE分析可以看出，目的蛋白多聚體被還原后只有一個(gè)單體條帶，表明分子間二硫鍵參與了1Dx5-N多聚體的形成.因此，中性條件更能促進(jìn)1Dx5-N通過(guò)分子間二硫鍵形成二聚體和高聚體，且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)(0～54 h)，二聚體和高聚體含量增加較快.以上結(jié)果表明，

圖4 處理時(shí)間和pH值對(duì)1Dx5-N聚集影響的SDS-PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant 1Dx5-N under different time and pH values

與酸性(pH=3.0)和堿性條件(pH=10.0)相比，中性條件更能促進(jìn)1Dx5-N形成二硫鍵，且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)(0～54 h)，中性條件下二硫鍵形成速度最快，堿性次之，酸性最慢.

綜合內(nèi)源熒光光譜、總自由巰基含量測(cè)定、非還原和還原SDS-PAGE的分析表明，中性環(huán)境更有利于1Dx5-N聚集，且分子間二硫鍵對(duì)聚集體的形成發(fā)揮了重要作用.

2.4 AFM分析

圖5為不同pH值下1Dx5-N的AFM照片.當(dāng)1Dx5-N處于中性條件下時(shí)，形成了少量的大聚集體顆粒，顆粒直徑在100 nm以上，同時(shí)還出現(xiàn)了大量顆粒直徑約50 nm的較小聚集體顆粒.但是，當(dāng)溶液pH值調(diào)節(jié)至酸性(pH=3.0)時(shí)，1Dx5-N的聚集體顆粒直徑減小，大顆粒聚集體消失，出現(xiàn)了大量顆粒直徑約20 nm的小蛋白顆粒；當(dāng)溶液pH值調(diào)節(jié)至堿性(pH=10.0)時(shí)，聚集體直徑進(jìn)一步減小，其顆粒直徑比酸性條件下更小.該結(jié)果與內(nèi)源熒光光譜和非還原SDS-PAGE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即中性條件下更有利于1Dx5-N聚集，聚集體顆粒較大；而在酸性和堿性條件下，1Dx5-N會(huì)發(fā)生解聚，導(dǎo)致聚集體顆粒較小.

圖5 不同pH處理下1Dx5-N的AFM照片

3 結(jié)論

采用內(nèi)源熒光光譜、總自由巰基定量、非還原和還原SDS-PAGE以及原子力顯微鏡等方法研究pH值對(duì)1Dx5-N聚集程度的影響，得到以下主要結(jié)論：

(1)與酸性和堿性條件下相比，中性條件下1Dx5-N的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)最小，色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性較低，表明該條件下1Dx5-N形成的聚集體程度增加；

(2)總自由巰基定量、非還原和還原SDS-PAGE測(cè)定結(jié)果顯示，中性條件下1Dx5-N巰基含量較酸性和堿性條件下偏低，且形成了更多的二聚體和多聚體，表明中性環(huán)境下更有利于1Dx5-N通過(guò)分子間二硫鍵進(jìn)行聚集；

(3)觀察發(fā)現(xiàn)，中性條件下1Dx5-N形成的聚集體顆粒直徑較大，進(jìn)一步說(shuō)明中性條件下有利于1Dx5-N的聚集.

基于以上分析，本研究從基礎(chǔ)理論層面證明了中性條件下進(jìn)行面制品加工的合理性.

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Effect of pH on Molecular Characteristics of N-Terminal Domain of Wheat HMW-GS 1Dx5

HUSong-qing1,2ZHANGYa-ping1WANGJing-jing1LIUGuang-yi1HUANGYan-bo1,3LILin1,2HOUYi3

(1.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China; 2.Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China;3.State Key Laboratory of Pulp and Paper Engineering, South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

By means of intrinsic fluorescence measurements, total free sulfhydryl (SH) quantitation, non-reducing and reducing SDS-PAGE analysis and AFM, the effect of pH on the forming of the N-terminal domain aggregation of high molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) 1Dx5 (1Dx5-N) was investigated.The results show that(1) in comparison with the acidic and alkaline conditions, the maximum emission wavelength of 1Dx5-N displays a blue shift under the neutral pH condition(pH 7.0),indicating that 1Dx5-N under the neutral pH condition has a higher degree of aggregation; (2)in comparison with the acidic and alkaline conditions, the 1Dx5-N under the neutral condition is of a lower total free sulfhydryl (SH) content with more dimers and polymers, indicating that, in the aggregation of 1Dx5-N,the neutral condition is more helpful and the disulfide bonds play an important role;and (3) under the neutral pH condition, the aggregation of greater particle size forms, which further proves that the neutral pH condition is superior to the acidic and alkaline conditions in terms of the aggregation of 1Dx5-N.Thus, the rationality of the flour product processing under the neutral condition is demonstrated at the molecular level.

high molecular weight glutenin subunit; N-terminal domain; aggregation

2016- 03- 11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171630,31471691，31130042)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20130172110018)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A010107002)；佛山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015AG10011) Foundation items: Supported by the National Natural Science Foundation of China(31171630,31471691,31130042)，the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20130172110018) and the Science and Technology Planning Project of Guangdong Province(2014A010107002)

胡松青(1972-)，男，博士，教授，主要從事食品蛋白質(zhì)生物化學(xué)研究.E-mail：fesqhu@scut.edu.cn

? 通信作者: 侯軼(1973-)，女，博士，高級(jí)工程師,主要從事生物質(zhì)利用研究.E-mail：ceyhou@scut.edu.cn

1000- 565X(2016)10- 0137- 06

TS 20

10.3969/j.issn.1000-565X.2016.10.020