水溶性大豆多糖對啤酒酵母懸濁液的絮凝作用*

高文宏 林平舟 鐘碧疆 曾新安

(華南理工大學 食品科學與工程學院， 廣東 廣州 510640)

水溶性大豆多糖對啤酒酵母懸濁液的絮凝作用*

高文宏 林平舟 鐘碧疆 曾新安

(華南理工大學 食品科學與工程學院， 廣東 廣州 510640)

采用酒石酸、六偏磷酸鈉和氫氧化鈉浸提豆渣制得大豆多糖SSPS P1、SSPS P2和SSPS P3，分別考察金屬陽離子(Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+)、多糖濃度、pH值以及溫度對SSPS絮凝啤酒酵母懸濁液的影響，并進行響應面試驗設計，優(yōu)化SSPS P1絮凝酵母懸濁液的條件，得到相應的數學回歸模型.單因素研究結果表明：3種水溶性大豆多糖中SSPS P1絮凝酵母懸濁液的效果最好；多數金屬離子對于3種SSPS的絮凝性起促進作用，其中Fe3+協同絮凝效果顯著，Fe3+濃度在0.025 mmol/L時效果最好；SSPS P1濃度和溫度也會影響絮凝啤酒酵母懸濁液的效果，SSPS P1質量濃度和溫度分別為10 mg/L和30 ℃時效果較好；強堿性環(huán)境有利于SSPS P1絮凝酵母懸濁液.分析數學回歸模型得到的絮凝最佳條件為SSPS P1質量濃度11.56 mg/L、Fe3+濃度0.26 mmoL/L、pH值 9.05、溫度30.68 ℃，絮凝率的預測值與實驗值非常接近，回歸模型能夠反映各因素對啤酒酵母懸濁液絮凝效果的影響.

水溶性大豆多糖；絮凝；啤酒酵母懸濁液；金屬陽離子；響應面法

在啤酒生產過程中，啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂，對啤酒質量起決定性作用[1- 2].經過主發(fā)酵和后發(fā)酵的釀造工藝之后，會產生大量廢啤酒酵母.啤酒酵母屬于真菌類，含有大量豐富的蛋白質、核酸、維生素和礦物質，對于廢酵母的利用多數是經過簡單加工制成粗蛋白飼料進入畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，更有甚者將其直接排入到江河中，不僅造成了資源的極大浪費還引起環(huán)境污染等一系列的問題.

絮凝是污水處理以及食品工業(yè)中的一道重要工序，通過向液體中添加絮凝劑使液體中懸浮微粒集聚或形成絮團從而加快粒子的聚沉，達到澄清污水或者食品料液的目的.傳統的無機絮凝劑存在投放量大、效率低甚至對人體有害的缺陷；合成絮凝劑由于其價格高、毒性大的缺點，應用也頗受限制；天然有機高分子絮凝劑原料來源豐富、價格低廉、可完全生物降解，此領域的開發(fā)受到了人們很大的關注.水溶性大豆多糖(SSPS)是一種水溶性多糖類物質[3]，其含有18%半乳糖醛酸的酸性多糖，相對分子質量為5 000～1 000 000，主鏈由鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖酸組成，側鏈由半乳聚糖和阿拉伯糖結合組成，整體結構與果膠類似[4- 10].已有的研究表明大豆多糖對于高嶺土懸濁液有很好的絮凝效果[11]，水溶性大豆多糖提取自豆渣中，無任何毒性.將水溶性大豆多糖或其改性產物用作高效絮凝劑使用，不僅可以提高水處理效率，而且對于回收絮凝物意義重大.文中采用3種不同方法提取水溶性大豆多糖，絮凝酵母，以期達到回收利用啤酒酵母、減少環(huán)境污染、高效利用豆渣及廢啤酒酵母這兩種食品工業(yè)廢棄資源的目的，從而提高啤酒工業(yè)的經濟效益和社會效益.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：豆渣，購自廣州市番禺區(qū)金伯樂調味品有限公司；啤酒酵母IF 02044，廣東省微生物研究所研制；六偏磷酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸、乙醇、丙酮均為分析純，廣州化學試劑廠生產.

主要儀器：分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司生產；TU-1901雙光束分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司生產；PHSJ-4A型實驗室pH計，上海精密科學儀器有限公司生產；XW-80A微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司生產.

1.2 實驗方法

1.2.1 水溶性大豆多糖的制備

實驗步驟[12- 15]：稱取豆渣，按表1的浸提條件加入溶劑浸提、過濾，再將殘渣反復提取3到4次后，對濾液進行濃縮、醇沉和離心，隨后分別用85%(體積分數)乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌固形物，最后將其置于烘箱中干燥至恒重.

表1 水溶性大豆多糖浸提條件

1)豆渣質量(g)和蒸餾水體積(mL)之比.

1.2.2 啤酒酵母懸濁液的制備

培養(yǎng)基配制：將0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.3%麥芽提取物和1.0%葡萄糖溶解后調節(jié)pH值至6.0.

啤酒酵母需氧搖床培養(yǎng)條件：培養(yǎng)時間為12 h、溫度28 ℃.

懸濁液的配制：將培養(yǎng)好的酵母在10 000 r/min下離心5 min，得到酵母沉淀，蒸餾水配制吸光值為1.400±0.005的酵母液作為絮凝懸濁液對象.

1.2.3 絮凝實驗方法

取酵母懸濁液9.3 mL，加入指定濃度絮凝劑溶液0.2 mL和指定濃度金屬陽離子溶液0.5 mL，混勻后采用微型旋渦儀震蕩1 min后靜置10 min，取上清液1 mL，稀釋，在550 nm下測定吸光值.將絮凝劑及助凝劑替換為蒸餾水做空白對照，其他操作不變，測定吸光值，按照式(1)計算絮凝率：

η=(A0-A1)/A0×100%

(1)

式中：A1為加入大豆多糖絮凝劑及鹽類助凝劑的吸光值；A0為空白組的吸光值；η為絮凝率.

依照此方法，將SSPS P1、SSPS P2、SSPS P3配成質量濃度為2 mg/L的溶液進行絮凝實驗，初步探討3種SSPS的絮凝活性.絮凝條件為30 ℃、pH=6.0.1.2.4 響應面中心組合實驗

選取SSPS P1質量濃度(ρ(SSPS P1))、Fe3+濃度(c(Fe3+))、pH值、溫度(θ) 4因素進行中心組合實驗.采用Design-Expert分析各因素對酵母懸濁液絮凝率的影響.

2 結果與分析

2.1 3種SSPS對啤酒酵母懸濁液的絮凝作用

如圖 1所示，在不添加任何金屬陽離子的條件下，3種SSPS對于啤酒酵母的絮凝效果不佳，絮凝率均比較低，其中SSPS P1效果最好，SSPS P2次之，SSPS P3幾乎不具有絮凝性.顯著性分析表明：SSPS P1的絮凝率顯著高于其余兩種大豆多糖.而在大豆多糖對高嶺土的絮凝效果中，不添加任何金屬離子條件下，SSPS P2絮凝率可以達到6.27%，SSPS P3也達到2.05%，SSPS P1幾乎不具絮凝效果[11]，這說明大豆多糖對于高嶺土和啤酒酵母的絮凝效果有顯著的不同.

圖1 3種SSPS對啤酒酵母懸濁液的絮凝效果比較

Fig.1 Comparison of flocculating property between three SSPSs in brewer yeast suspension

不同字母表示顯著性差異

2.2 金屬陽離子協同SSPS對酵母懸濁液絮凝的影響

2.2.1 金屬陽離子種類對3種SSPS絮凝活性的影響

依照1.2.3節(jié)的方法，絮凝條件定為30 ℃、金屬陽離子濃度為0.25 mmol/L、SSPS質量濃度ρ(SSPS)為10 mg/L，pH=6.0，分別測定Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+存在下酵母懸濁液的絮凝率，結果如圖2所示.由圖可以看出，多數金屬離子對3種SSPS的絮凝性起促進作用.其中，Fe3+配合SSPS P1以及SSPS P2的促進作用最好，絮凝率達到了60%左右；除此之外，Al3+對于SSPS P2也有很好的促進效果，絮凝率接近20%；其他金屬陽離子對于3種SSPS的絮凝性促進作用均不大，絮凝率在10%左右或者更低的水平.需要指出的是,Ca2+、Fe2+以及Mg2+配合SSPS P3對絮凝性均無促進作用.

圖2 金屬陽離子種類對SSPS絮凝啤酒酵母懸濁液的影響

Fig.2 Effects of metal cation types on flocculating property of SSPSs in brewer yeast suspension

2.2.2 Fe3+濃度對SSPS P1以及SSPS P2絮凝活性的影響

固定絮凝條件為30 ℃、ρ(SSPS)為10 mg/L、pH=6.0，分別測定c(Fe3+)為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 mmol/L下酵母懸濁液的絮凝率，Fe3+濃度對SSPS P1及SSPS P2絮凝活性的影響如圖3所示.從圖中可看出，Fe3+濃度小于0.25 mmol/L時，SSPS P1及SSPS P2絮凝率均隨Fe3+濃度的增加而增加，Fe3+濃度為0.25 mmol/L時，SSPS P1和SSPS P2絮凝率分別達到最大值64.8%和59.1%.當Fe3+的濃度大于0.25 mmol/L時，由于過量鐵離子無法與大豆多糖形成架橋發(fā)揮絮凝作用，二者絮凝率隨金屬離子濃度的增加而減少.從圖中也可看出，Fe3+和SSPS P1協同絮凝效果優(yōu)于和SSPS P2的，由此選定SSPS P1進行后續(xù)實驗.

圖3 Fe3+濃度對SSPS P1及SSPS P2絮凝活性的影響

Fig.3 Effects of Fe3+concentrations on flocculating activity of SSPS P1and SSPS P2

2.3 SSPS P1質量濃度對絮凝啤酒酵母懸濁液的影響

由2.2節(jié)的結論，考察ρ(SSPS P1)分別為0、5、10、15、20 mg/L時，SSPS P1對啤酒酵母絮凝率變化的影響，絮凝條件為30 ℃、c(Fe3+)為0.25 mmol/L、pH=6.0,結果見圖4.隨著SSPS P1質量濃度增加絮凝率先增加后減小，SSPS P1質量濃度為10 mg/L時絮凝率取得最大值.

圖4 SSPS P1質量濃度對含Fe3+啤酒酵母懸濁液絮凝性的影響

Fig.4 Effects of SSPS P1mass concentrations on flocculating brewer yeast suspension containing Fe3+

2.4 pH值對SSPS P1絮凝啤酒酵母懸濁液的影響

依照1.2.3節(jié)的方法，固定絮凝條件30 ℃、c(Fe3+)為0.25 mmol/L、ρ(SSPS P1)為10 mg/L，分別測定pH值為1、3、5、7、9、11、12時酵母懸濁液的絮凝率.不同pH值對絮凝率的影響結果如圖 5所示.由圖可知，隨著pH值的增加，SSPS P1的絮凝性逐步增加，當達到強堿性條件(pH≥11)時，絮凝率接近100%.這說明堿性條件有利于SSPS P1對啤酒酵母懸濁液的絮凝.但強堿性會導致蛋白變性，可能會對啤酒酵母的回收利用產生不利影響.

圖5 pH值對SSPS P1絮凝啤酒酵母懸濁液的影響

Fig.5 Effects of pH values on flocculating brewer yeast suspension with SSPS P1

2.5 溫度對SSPS P1絮凝啤酒酵母懸濁液的影響

絮凝條件為：c(Fe3+)為0.25 mmol/L、ρ(SSPS P1)為10 mg/L、pH=6.0,分別測定溫度在15～50 ℃范圍內的絮凝率，結果如圖6所示.由圖可知：隨著溫度升高絮凝率增加，當溫度達到30 ℃時，絮凝率達最大值68.89%，溫度繼續(xù)升高，絮凝率下降.這說明溫度過高或過低都不利于SSPS P1對啤酒酵母懸濁液的絮凝，在最優(yōu)的絮凝溫度下，絮凝率最高.

圖6 溫度對SSPS P1絮凝啤酒酵母懸濁液的影響

Fig.6 Effect of temperature on flocculating brewer yeast suspension with SSPS P1

2.6 SSPS P1絮凝酵母懸濁液條件的響應面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，根據中心組合設計(CCD)原理，以SSPS P1質量濃度、Fe3+濃度、絮凝溫度、體系pH值 4個因素為自變量(以A、B、C、D表示)，以絮凝率為響應值，設計了四因素五水平試驗，探索SSPS P1絮凝啤酒酵母的最優(yōu)條件.表 2為響應面中心組合設計的因素和水平，試驗設計與結果見表3.

表2 響應面中心組合設計的因素和水平

Table 2 Factors and levels of response surface central composite design

水平ρ(SSPSP1)/(mg·L-1)c(Fe3+)/(mmol·L-1)pH值θ/℃-250．05620-1100．157250150．208301200．359352250．451040

表3 中心組合試驗設計及結果

2.6.1 模型的建立與顯著性分析

利用Design Expert(v8.0724)軟件對表 3中所得數據進行二次多項回歸擬合，可以獲得SSPS P1質量濃度(A)、Fe3+濃度(B)、pH值(C)、溫度(D)和絮凝率(Y)之間的二次多項式回歸方程為：

Y=58.86-7.93A+2.13B+5.63C+2.95D+

4.33AB-0.29AC+1.50AD+2.36BC+

2.51BD-1.56CD-5.41A2-7.18B2-

2.83C2-2.29D2

(2)

對統計測試模型進行方差分析，絮凝率的二次多項式擬合模型的方差分析和回歸方程系數見表4.可知，回歸方程失擬檢驗不顯著(P=0.067 2)，這說明未知因素對于試驗結果的干擾非常小，擬合檢驗極顯著(P<0.000 1)，方程一次項中SSPS P1質量濃度、pH值的影響極其顯著，溫度對絮凝效果影響顯著，交互項AB的影響顯著，二次項A2、B2的影響達到了極顯著的水平，C2、D2的影響達到了顯著水平，說明4個因素對絮凝率的影響均有二次關系.該模型的復相關系數R2=0.926 2，說明該模型與實驗值擬合很好，較好地反映了絮凝率與SSPS P1質量濃度、Fe3+濃度、pH值以及絮凝溫度的關系，因此所得回歸方程可以較好地預測SSPS P1絮凝啤酒酵母過程中，絮凝率受各種因素影響的變化規(guī)律.

表4 響應面二次模型方差分析1)Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic mode

1)復相關系數(R2)為0.926 2；校正復相關系數為0.853 4；預測復相關系數為0.600 6；信噪比為10.138.

2.6.2 響應面分析

為考察交互項對啤酒酵母絮凝效果的影響，在其他因素各條件固定不變的情況下，對模型進行降維分析，經Design-Expert軟件分析所得到結果見圖7.

圖7 溫度、pH值、SSPS P1質量濃度、Fe3+濃度對啤酒酵母絮凝交互影響的三維曲面圖

Fig.7 Response surface plots showing the mutual interactions between temperature,pH values,the mass concentration of SSPS P1and the concentration of Fe3+on flocculation of yeast

從圖7中可以看出，隨著每個因素的增大，響應值增大；響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小.其中較為明顯的是Fe3+濃度、SSPS P1質量濃度、溫度.隨著pH值的增大絮凝率逐漸增大，這表明相當的范圍內堿性環(huán)境有利于啤酒酵母的絮凝，這與單因素分析的結果基本吻合.

通過響應面分析優(yōu)化得到SSPS P1對啤酒酵母絮凝的最佳條件為SSPS P1質量濃度為11.56 mg/L、Fe3+濃度為0.26 mmol/L、pH值為 9.05、溫度為30.68 ℃，絮凝率預測值為64.89%.據優(yōu)化條件實驗得到絮凝率為62.52%，接近預測值，說明回歸模型能夠反應因素對絮凝效果的影響.

3 結論

文中采用3種不同浸提劑提取的水溶性大豆多糖作為絮凝劑，絮凝酵母懸濁液.單因素實驗結果表明：SSPS P1絮凝效果最好，濃度過高或過低均不利于絮凝；實驗中7種金屬陽離子均能激活SSPS P1和SSPS P2的絮凝活性，所有組中Fe3+與SSPS P1的組合絮凝率最高，Fe3+與SSPS P2的效果次之，其他金屬離子協同SSPS的絮凝率均在20%以下；強堿性條件有利于酵母的絮凝，隨pH值的增大，絮凝率增大；過高或過低的溫度均不利于酵母的絮凝.綜合SSPS P1質量濃度、Fe3+濃度、pH值和溫度所做的響應面分析表明:SSPS P1質量濃度、pH值對絮凝率的影響極其顯著，溫度對絮凝效果影響顯著，SSPS P1質量濃度和Fe3+存在交互作用，而4個因素對絮凝率的影響均有二次關系存在.響應面優(yōu)化啤酒酵母懸濁液的最佳條件為：SSPS P1質量濃度為11.56 mg/L、Fe3+濃度為0.26 mmol/L、pH值為 9.05、溫度為30.68 ℃，絮凝率預測值為64.89%，實驗測得值為62.52%，與理論值接近，說明回歸模型能夠反應各因素對絮凝效果的影響.

[1] POWELL C D,QUAIN D E,KA S.The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance,attenuation and flocculation [J].FEMS Yeast Research,2003,3(2)：149- 157.

[2] LIU Z,ZHANG G,LIU S.Constructing an amylolytic brewing yeastSaccharomycespastorianussuitable for accelerated brewing [J].Journal of Bioscience & Bioengineering,2004,98(6)：414- 419.

[3] WANG Q,HUANG X,NAKAMURA A,et al.Molecular characterisation of soybean polysaccharides:an approach by size exclusion chromatography,dynamic and static light scattering methods [J].Carbohydrate Research,2005,340(17)：2637- 2644.

[4] 楊曉泉,齊軍茹,司華靜,等.大豆多糖的研究進展及在含乳飲料、米面等食品上的應用 [J].中國食品添加劑,2008(3)：135- 139. YANG Xiao-quan,QI Jun-yu,SI Hua-jing,et al.Research on soybean soluble polysaccharide and its application in food industry [J].China Food Additives,2008(3):135- 139.

[5] 譚永輝,王文生,秦玉昌,等.豆渣中水溶性大豆多糖的提取與應用 [J].大豆科學,2008,27(1)：150- 153. Tan Yong-hui,Wang Wen-sheng,Qin Yu-chang,et al.Extraction and application of soluble soybean polysaccharides from bean curd waste [J].Soybean Science,2008,27(1):150- 153.

[6] 趙國志,劉喜亮,劉智鋒.水溶性大豆多糖類開發(fā)與應用 [J].糧食與油脂,2006 (8)：15- 17. ZHAO Guo-zhi,LIU Xi-liang,LIU Zhi-feng.Development and application of soybean polysacchandes [J].Cereals & Oils,2006(8):15- 17.

[7] LI J,MATSUMOTO S,NAKAMURA A,et al.Characteri-zation and functional properties of sub-fractions of soluble soybean polysaccharides [J].Bioscience Biotechnology & Biochemistry,2014,73(12)：2568- 2575.

[8] KARR-LILIENTHAL L K,Kadzere C T,Grieshop C M,et al.Chemical and nutritional properties of soybean carbohydrates as related to nonruminants:a review [J].Livestock Production Science,2005,97(1)：1- 12.

[9] FRANSEN C T,HASELEY S R,HUISMAN M M,et al.Studies on the structure of a lithium-treated soybean pectin:characteristics of the fragments and determination of the carbohydrate substituents of galacturonic acid [J].Carbohydrate Research,2000,328(4)：539- 547.

[10] NAKAMURA A,TAKAHASHI T,YOSHIDA R,et al.Emulsifying properties of soybean soluble polysaccharide [J].Food Hydrocolloids,2004,18(5)：795- 803.

[11] 鐘碧疆,高文宏.大豆多糖絮凝性研究 [J].食品科技,2011,36(5):80- 82. ZHONG Bi-jiang,GAO Wen-hong.The flocculation properties of soluble soybean polysaccharide [J].Food Science and Technology,2011,36(5):80- 82.

[12] 尹艷,高文宏,于淑娟.豆渣中水溶性大豆多糖提取工藝的研究 [J].食品工業(yè)科技,2006,27(8)：97- 98. YIN Yan,GAO Wen-hong,YU Shu-juan.Study on the extraction of soluble soybean polysaccharides from soybean by-products [J].Science and Technology of Food Industry,2006,27(8):97- 98.

[13] 孟岳成,邱蓉,張學兵.堿法提取可溶性大豆多糖的工藝 [J].食品研究與開發(fā),2009,30(11)：83- 86. MENG Yue-cheng,QIU Rong,ZHANG Xue-bing.Stu-dies on the extraction of soybean polysaccharides from okara by alkali-extraction [J].Food Research and Development,2009,30(11):83- 86.

[14] 熊杰,楊玥熹,華欲飛.大豆渣水溶性大豆多糖提取工藝研究 [J].糧食與油脂,2009(8)：38- 40. XIONG Jie,YANG Yue-xi,HUA Yu-fei.Extraction technology of soluble soybean polysaccharides from bean dregs [J].Soybean Science,2009(8):38- 40.

[15] FURUTA H,MAEDA H.Rheological properties of water-soluble soybean polysaccharides extracted under weak acidic condition [J].Food Hydrocolloids,1999,13(3)：267- 274.

Flocculation Effect of Water Soluble Soybean Polysaccharides on Brewer Yeast Suspension

GAOWen-hongLINPing-zhouZHONGBi-jiangZENGXin-an

(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

Three kinds of water soluble soybean polysaccharides,namely,SSPS P1,SSPS P2and SSPS P3,were extracted from soy bean dregs by using tartaric acid,sodium hexametaphosphate and sodium hydroxide.Then,the flocculation effects of the SSPS on the brewer yeast suspension with different metal cations (Al3+,Fe3+,Fe2+,Mg2+,Ca2+,K+and Na+),polysaccharide concentrations,pH values and temperatures were respectively investigated.Moreover,the response surface experiment design was performed to optimize the flocculation conditions,and a corresponding mathematical regression model was constructed.Single factor research results show that (1) SSPS P1has the best effect in flocculating the brewer yeast suspension;(2) most of the metal cations increase the flocculation effects,among which Fe3+shows the best performance;(3) when the Fe3+concentration reaches 0.025 mmol/L,the best flocculation effect can be achieved;(4)the flocculation effects can also be influenced by the SSPS P1concentration and the temperature,and the effects are better at 10 mg/L and 30 ℃;and (5) a strong alkaline environment is helpful in adopting SSPS P1to flocculate the brewer yeast suspension.The analytical results based on the constructed model indicate that the optimal flocculating condition is a SSPS P1mass concentration of 11.56 mg/L,a Fe3+concentration of 0.26 mmol/L,a pH value of 9.05 and a temperature of 30.68 ℃,and the experimental value of the flocculating rate under the optimal condition is very close to the predicted one,which means that the constructed model can reflect the influence of various factors on the flocculation effect.

water soluble soybean polysaccharides;flocculation;brewer yeast suspension;metal cation;response surface methodology

2015- 07- 15

國家自然科學基金資助項目(21376094)；廣東省科技計劃項目(2013B020203001,2012A020200002) Foundation items: Supported by the National Natural Science Foundation of China(21376094)and the Science and Technology Program of Guangdong Province(2013B020203001,2012A020200002)

高文宏(1970-)，女，博士，副教授，主要從事食品質量與安全方面的研究.E-mail：gaowh@scut.edu.cn

1000- 565X(2016)10- 0125- 07

TS 201.2

10.3969/j.issn.1000-565X.2016.10.018