木薯華南8號(hào)組培苗對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)

薛晶晶， 朱文麗， 陳松筆

( 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 儋州 571737 )

木薯華南8號(hào)組培苗對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)

薛晶晶， 朱文麗， 陳松筆*

( 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 儋州 571737 )

以NaCl脅迫生長(zhǎng)的木薯 (Manihotesculenta) 華南8號(hào)(SC8)組培苗為材料，研究不同濃度(0、5、20、35、50 mmol·L-1及R50 mmol·L-1)NaCl處理對(duì)SC8組培苗的生長(zhǎng)狀況及葉綠素、過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的影響。結(jié)果表明：≤20 mmol·L-1的NaCl脅迫60 d對(duì)SC8組培苗的生長(zhǎng)基本無影響；≥35 mmol·L-1的 NaCl脅迫60 d抑制了SC8組培苗的生長(zhǎng)，但高濃度(50 mmol·L-1)脅迫30 d后正常培養(yǎng)30 d，可以使SC8組培苗的長(zhǎng)勢(shì)得到恢復(fù)。葉綠素和MDA含量在≤35 mmol·L-1NaCl處理下較對(duì)照出現(xiàn)積累現(xiàn)象，隨NaCl濃度升高(≥50 mmol·L-1)含量開始下降；與對(duì)照相比，H2O2含量在NaCl脅迫下未出現(xiàn)積累現(xiàn)象。NaCl脅迫下，POD、CAT和APX活性較對(duì)照均有所提高；較高濃度的NaCl處理下，SOD、CAT和APX活性開始降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，≥50 mmol·L-1NaCl 脅迫下，SOD、CAT、POD和APX的表達(dá)水平較對(duì)照出現(xiàn)上升現(xiàn)象。這說明短時(shí)間的鹽脅迫不會(huì)對(duì)木薯造成致死傷害，可以通過調(diào)節(jié)生理指標(biāo)的活性來提高木薯的耐鹽性。

木薯， NaCl處理， 生理指標(biāo)測(cè)定， 相關(guān)性分析， Q-PCR

木薯(Manihotesculenta)是大戟科(Euphorbiaceae)木薯屬(Manihot)多年生植物，是世界三大薯類作物之一(Rogers, 1963)。木薯貯藏根淀粉含量在27%～34%之間，被譽(yù)為“淀粉之王”，是世界熱帶地區(qū)繼水稻、玉米、高粱之后的第四大糧食作物，為熱帶、亞熱帶近8億人口提供了基本食糧，是我國(guó)重要的工業(yè)淀粉和生物質(zhì)能源原料，也是我國(guó)潛在的糧食作物(Gu et al, 2013)。木薯耐旱耐貧瘠，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在熱帶亞熱帶相對(duì)貧瘠地區(qū)廣泛種植，鹽漬地種植不多。目前，有關(guān)木薯耐鹽方面的研究尚不多，鹽脅迫下植物酶促保護(hù)系統(tǒng)主要酶的活性變化機(jī)理仍不清楚。本研究以不同濃度NaCl處理的華南8號(hào)組培苗為材料，研究鹽脅迫下其相關(guān)生理指標(biāo)變化趨勢(shì)以及部分生理指標(biāo)轉(zhuǎn)錄本水平，探討鹽脅迫下的變化規(guī)律，為進(jìn)一步了解木薯鹽脅迫傷害的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為擴(kuò)大木薯種植區(qū)域提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取生長(zhǎng)40 d左右的木薯華南8號(hào)(SC8)組培苗莖段，分別放于含有0、5、20、35、50 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上，每瓶放置5個(gè)莖段，每個(gè)處理濃度培養(yǎng)30瓶(其中，50 mmol·L-1為60瓶)。其中，將含50 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)30 d后的組培苗轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上(以R50 mmol·L-1表示)。待所有處理均生長(zhǎng)60 d，取不同處理的葉片進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定和RNA提取，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫下不同生理指標(biāo)的測(cè)定 利用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素含量；利用電導(dǎo)儀法測(cè)定細(xì)胞膜透性(李合生，2006)；植物丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的測(cè)試盒，測(cè)定MDA、H2O2、CAT、SOD、POD含量，所有測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)試方法按說明書進(jìn)行；抗壞血酸過氧化物酶(APX)試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，測(cè)試方法按說明書進(jìn)行。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 木薯組培苗葉片RNA提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Tiangen)的操作說明進(jìn)行，用Dnase I柱上消化RNA樣品中殘留的微量DNA。cDNA第一鏈的合成參照TransScript Reverse Transcriptase(TransGen)操作說明書進(jìn)行。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用Thermo公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)操作按儀器使用說明書進(jìn)行。取1 μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，稀釋10倍后作為實(shí)時(shí)定量PCR分析的模板。10 μL反應(yīng)體系中，包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol·L-1QPCR -F和QPCR -R引物(表1)各0.5 μL、滅菌水補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s、共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)完后進(jìn)行產(chǎn)物溶解曲線分析。以MeActin作為內(nèi)參基因(表1)，以2-△△Cq算法進(jìn)行基因的相對(duì)定量表達(dá)。采用Duncan多重比較對(duì)對(duì)照和處理樣品的相對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表 1 引物序列

1.3 分析方法及數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prifm 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，用SPSS18.0軟件進(jìn)行差異性等相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)木薯SC8組培苗生長(zhǎng)情況的影響

低濃度的鹽脅迫對(duì)SC8組培苗的影響不明顯，但當(dāng)濃度提高到50 mmol·L-1時(shí)，SC8組培苗的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制，生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)SC8生長(zhǎng)30 d后，將部分受50 mmol·L-1NaCl脅迫的組培苗轉(zhuǎn)至正常MS培養(yǎng)基上，30 d后SC8組培苗的長(zhǎng)勢(shì)慢慢恢復(fù)，較50 mmol·L-1鹽脅迫下的長(zhǎng)勢(shì)好(圖1)。

2.2 鹽脅迫對(duì)木薯SC8組培苗不同生理指標(biāo)含量的影響

鹽脅迫會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，進(jìn)而對(duì)植物細(xì)胞形成氧化脅迫傷害。所以，活性氧清除能力的高低反應(yīng)了植物耐鹽性的強(qiáng)弱。SOD、CAT、POD及APX是酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，可以有效地清除膜脂過氧化物對(duì)植物造成的傷害。MDA可以用來衡量膜損傷的程度。

20 mmol·L-1鹽脅迫下，葉綠素和MDA的含量最高；隨著鹽濃度增加，葉綠素和MDA含量逐漸下降，至50 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)，含量達(dá)到最低；但是經(jīng)過50 mmol·L-1鹽脅迫后，在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的SC8組培苗，其葉綠素含量有很大提高，而MDA含量卻略微下降(圖2)。相對(duì)電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜受傷害的程度，5 mmol·L-1鹽脅迫下，相對(duì)電導(dǎo)率最高；隨著鹽脅迫濃度的增加，相對(duì)電導(dǎo)率下降。R50 mmol·L-1鹽脅迫下，其相對(duì)電導(dǎo)率也略有上升。CAT是對(duì)H2O2分解的活力單位，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí)，CAT活力達(dá)最大值，而R50 mmol·L-1鹽脅迫下，CAT活力下降；而H2O2含量與其呈相反趨勢(shì)。35 mmol·L-1鹽脅迫下，APX和POD的活性最高。鹽濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí)，其APX活性下降到最低；恢復(fù)生長(zhǎng)后，APX活性有所上升，但POD的活性基本無變化。SOD活力隨著鹽脅迫濃度的升高而降低，20 mmol·L-1鹽脅迫下，SOD活力最低。這表明木薯SC8組培苗受到50 mmol·L-1NaCl脅迫時(shí)，生長(zhǎng)被抑制，進(jìn)而影響其生理指標(biāo)的含量；而R50 mmol·L-1的鹽脅迫下，其相關(guān)生理指標(biāo)含量會(huì)隨之恢復(fù)。

2.3 不同生理指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)葉綠素含量、膜透性、MDA、SOD、CAT、H2O2、POD及APX進(jìn)行相關(guān)性分析(表2)。正常情況下，CAT與H2O2呈極顯著正相關(guān)；當(dāng)添加5 mmol·L-1的NaCl時(shí)，其生理指標(biāo)無顯著相關(guān)性；繼續(xù)添加NaCl至20 mmol·L-1時(shí)，CAT與POD呈極顯著負(fù)相關(guān)；當(dāng)進(jìn)行35 mmol·L-1的鹽脅迫時(shí)，細(xì)胞膜傷害度與MDA、CAT呈顯著負(fù)相關(guān)，而與SOD呈極顯著正相關(guān)；SOD與MDA、CAT呈顯著負(fù)相關(guān)，MDA與CAT呈極顯著正相關(guān)，APX與POD呈顯著正相關(guān)；當(dāng)鹽脅迫濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí)，其生理指標(biāo)無顯著相關(guān)性；當(dāng)50 mmol·L-1鹽脅迫恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，葉綠素含量與細(xì)胞膜傷害度呈顯著負(fù)相關(guān)，POD與MDA呈顯著負(fù)相關(guān)；說明一定濃度的鹽脅迫(35 mmol·L-1)對(duì)木薯組培苗的生長(zhǎng)具有抑制作用，其細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重傷害，從而通過調(diào)節(jié)其他生理指標(biāo)的含量來提高木薯耐鹽性；當(dāng)50 mmol·L-1鹽脅迫恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，木薯組培苗受到的傷害也逐漸恢復(fù)，表明短時(shí)間的鹽脅迫不會(huì)對(duì)木薯造成毀滅性傷害，可以通過正常培養(yǎng)恢復(fù)生長(zhǎng)。

表 2 鹽脅迫下不同生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

注： *. 0.05 水平上顯著相關(guān)；**. 0.01 水平上顯著相關(guān)。

Note: *. indicates significant correlation among different indexes at 0.05 level; **. indicates significant correlation among different indexes at 0.01 level.

圖 1 木薯SC8組培苗在不同濃度鹽脅迫下生長(zhǎng)30 d (A)和60 d (B)的狀況Fig. 1 Growth status of cassava SC8 tissue culture seedlings under different concentrations of salt stresses for 30 d (A) and 60 d (B)

圖 2 不同濃度鹽脅迫下生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)Fig. 2 Variation tendency of the physiological indexes under different concentrations of salt stresses

2.4 生理指標(biāo)相關(guān)基因的表達(dá)分析

根據(jù)木薯已克隆的POD基因序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)引用已發(fā)表CAT、SOD和APX的定量PCR引物序列(Xu et al, 2013, 2014)，對(duì)不同濃度鹽脅迫后的木薯SC8組培苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本水平的表達(dá)分析。圖3顯示，不同鹽濃度脅迫下，APX的相對(duì)表達(dá)量與其生理含量呈相反趨勢(shì)；50 mmol·L-1時(shí)，APX的表達(dá)水平最高；當(dāng)組培苗恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，其表達(dá)水平明顯下降。POD和SOD的表達(dá)量在50 mmol·L-1脅迫和50 mmol·L-1恢復(fù)處理下變化不大。CAT的表達(dá)水平隨著鹽濃度增加，表達(dá)量降低；而組培苗恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，其表達(dá)水平到達(dá)最低水平。

圖 3 鹽脅迫下，不同生理指標(biāo)相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig. 3 Expression level of genes of different physiological indexes under salt stress

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)受到抑制是植物遭受鹽害最直觀及最顯著的效應(yīng)(Munns, 2002)。鹽分對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制機(jī)理是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的問題，不同鹽類和同一鹽類不同鹽濃度、不同植物和同一植物不同器官、不同發(fā)育階段以及鹽脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短等，都會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，鹽分的抑制機(jī)理也不相同。本研究中，5 mmol·L-1和20 mmol·L-1的NaCl處理下，生長(zhǎng)30 d的木薯SC8組培苗與對(duì)照相比無差異。當(dāng)鹽濃度提高至50 mmol·L-1時(shí)，木薯SC8的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制(圖1)；將50 mmol·L-1NaCl處理30 d的SC8組培苗部分移至正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)30 d后其生長(zhǎng)發(fā)育恢復(fù)正常，與未處理的SC8組培苗長(zhǎng)勢(shì)無差異?？梢?，短時(shí)間的鹽脅迫對(duì)植物的抑制作用可以恢復(fù)，植物在含鹽環(huán)境下會(huì)開啟自我保護(hù)模式來降低鹽脅迫帶來的傷害(肖強(qiáng)等，2003) 。

鹽脅迫下，植物會(huì)通過發(fā)生氧化脅迫來破壞酶系統(tǒng)對(duì)氧代謝的平衡，植物通過提高自身的抗氧化系統(tǒng)活力來平衡活性氧代謝(Cheruth et al, 2007)。同時(shí)，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)H2O2和MDA含量增加(尤佳等，2012；魯艷等，2014；李曉雅等，2015)。本研究中，SC8 組培苗MDA的含量隨著NaCl濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，H2O2的含量在35 mmol·L-1NaCl處理時(shí)，達(dá)到最大；與菊芋塊莖鹽脅迫10 d的變化趨勢(shì)一致(張喜洋和于濤，2015)，而與多枝生檉柳、亞麻薺的研究結(jié)果略有不同(魯艷等，2014；李曉雅等，2015)?？赡苁且?yàn)椋旱谝?，本研究采用的是SC8組培苗，其莖段的成熟度不同，同樣生長(zhǎng)環(huán)境下存在個(gè)體差異，且NaCl是直接加入MS培養(yǎng)基中，組培苗的生長(zhǎng)有一個(gè)較長(zhǎng)的適應(yīng)過程；第二，SC8組培苗生長(zhǎng)60 d后，隨機(jī)選取3個(gè)培養(yǎng)瓶中的葉片進(jìn)行H2O2和MDA含量測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果會(huì)有一定的偏差。

植物體內(nèi)具有復(fù)雜的抗氧化酶系統(tǒng)，能夠清除脅迫產(chǎn)生的大量ROS。本研究表明，鹽脅迫下植物體內(nèi) SOD、CAT、APX和POD等抗氧化酶活性的增強(qiáng)有利于減少體內(nèi)ROS積累，從而減輕ROS引起的過氧化傷害(Dehghan et al, 2013; Mishra et al, 2013; Seckin et al, 2010)。本研究中，低濃度鹽脅迫時(shí)，SOD、CAT、APX、POD等酶活性無顯著變化，表明木薯可以通過調(diào)節(jié)酶活性來減少鹽脅迫產(chǎn)生的超氧化物自由基的傷害；但是當(dāng)鹽濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí)，脅迫產(chǎn)生的傷害越來越嚴(yán)重，SC8組培苗無法保持高水平的酶活性，酶活力下降。這一結(jié)果與多枝檉柳、棉花、大麥、煙草的研究結(jié)果類似(魯艷等，2014; Meloni et al, 2003; Badawi et al, 2004; Liang et al, 2003)。另外，50 mmol·L-1NaCl處理30 d后恢復(fù)生長(zhǎng)的SC8組培苗的APX酶活性會(huì)提高，但是 SOD、CAT、MDA、POD等含量低于50 mmol·L-1NaCl脅迫時(shí)的含量，推測(cè)可能是鹽脅迫產(chǎn)生的傷害未消除，使其酶活性受到了影響。本研究進(jìn)一步對(duì)APX、SOD、CAT及POD相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明：鹽脅迫下，APX的相對(duì)表達(dá)量與其生理含量呈相反趨勢(shì)；NaCl濃度達(dá)50 mmol·L-1時(shí)，APX的表達(dá)水平最高；當(dāng)組培苗恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，其表達(dá)水平明顯下降。POD和SOD的表達(dá)量在50 mmol·L-1NaCl脅迫和恢復(fù)處理后變化不大；而CAT表達(dá)水平隨著鹽濃度增加而降低?；虻谋磉_(dá)水平與生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)存在差異，可能是因?yàn)椋旱谝?，本研究中每個(gè)酶只選擇其中的一個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)水平分析，而不是分析整個(gè)家族的基因，存在一定的片面性；第二，酶起作用時(shí)還會(huì)受到其他的修飾，而基因的表達(dá)只是單一的轉(zhuǎn)錄本水平。

本研究是對(duì)不同濃度鹽脅迫下的木薯SC8組培苗進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，該組培苗在培養(yǎng)時(shí)一直處于鹽脅迫狀態(tài)；我們將SC8組培苗移栽至大田中，比較其與正常種植的木薯SC8的田間長(zhǎng)勢(shì)；進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫，對(duì)鹽脅迫后的SC8組培苗的耐鹽性與正常種植的SC8進(jìn)行研究，為木薯耐鹽種質(zhì)的選育及木薯耐鹽機(jī)理的研究提供依據(jù)。

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Physiological mechanism of cassava South China 8 tissue culture seedling under salt stress

XUE Jing-Jing, ZHU Wen-Li, CHEN Song-Bi*

( Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory ofConservationandUtilizationforCassavaGermplasmResources, Danzhou 571737, Hainan, China )

The cassava (Manihotesculenta) South China 8 (SC8) tissue culture seedlings were conducted to investigate the physiological mechanism in response to salt stress. Effects of MS medium treatment contained NaCl (0, 5, 20, 35, 50 mmol·L-1and R50 mmol·L-1) on the growth and physiological indexes activities of Cassava SC8 tissue culture seedlings were evaluated. The physiological indexes include chlorophyll, hydrogen peroxide (H2O2), malonaldehyde (MDA) content, and the activities of superoxide dismutases (SOD), catalases (CAT), peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX). The results of physiological showed that the growth of SC8 tissue culture seedlings did not change significantly after NaCl content (≤20 mmol·L-1) stress for 60 d, but high content (≥35 mmol·L-1) of the stress had inhibited SC8 tissue culture seedlings growth. The growth of SC8 tissue culture seedlings could be recovered at NaCl concent (50 mmol·L-1) stress for 30 d after they were transferred to the normal MS medium of 30 d. Chlorophyll and MDA contents were accumulated at NaCl content(≤35 mmol·L-1) stress, but which were not accumulated at NaCl content(≥50 mmol·L-1) stress. H2O2content had no obvious change at NaCl content stress which it was compared with control. Activities of antioxidant enzymes including POD, CAT and APX were increased at NaCl stress, whereas the activities of SOD, CAT and APX were decreased at higher NaCl stress. The results of real-time quantitative PCR showed that the expression level of SOD, CAT, POD and APX were higher than control at NaCl content(≥50 mmol·L-1)stress. The results indicated that salt stress for a short period of time would not cause devastating damage to cassava, which could improve the salt tolerance of cassava by regulating the activity of physiological indexes.

cassava, NaCl stress, physiological indexes measuring, correlation analysis, Q-PCR

10.11931/guihaia.gxzw201510027

2015-10-27

2016-01-26

國(guó)家“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2012AA101204-2)；海南省高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才啟動(dòng)基金；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630032013005) [Supported by National Scientific and Technological Programs in Rural Fields(2012AA101204-2); the Initial Fund of High-levele Creative Talents in Hainan Province; the National Nonprofit Institute Research Grant of CATAS-TCGRI(1630032013005)]。

薛晶晶(1983-)，女，河南靈寶人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)槟臼砘蚩寺『捅碛^遺傳學(xué)研究，(E-mail) xuetao608@163.com。

*通訊作者： 陳松筆，博士，研究員，從事木薯蛋白質(zhì)組學(xué)研究，(E-mail) songbichen@hotmail.com。

Q945.78

A

1000-3142(2016)12-1460-08

薛晶晶， 朱文麗， 陳松筆. 木薯華南8號(hào)組培苗對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)[J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1460-1467

XUE JJ, ZHU WL, CHEN SB. Physiological mechanism of cassava South China 8 tissue culture seedling under salt stress[J]. Guihaia， 2016， 36(12):1460-1467