黑蒴定芽誘發(fā)增殖的初步研究

李育川， 房海靈， 王定康， 向曉東， 靳 松， 耿開友*

( 1. 昆明學(xué)院， 昆明 650214； 2. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所， 南京 210014； 3. 大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 云南 大理 671003 )

黑蒴定芽誘發(fā)增殖的初步研究

李育川1， 房海靈2， 王定康1， 向曉東3， 靳 松1， 耿開友1*

( 1. 昆明學(xué)院， 昆明 650214； 2. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所， 南京 210014； 3. 大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 云南 大理 671003 )

黑蒴(Melasmaarvense)為云南省民族民間珍稀藥材，現(xiàn)已成為云南天然藥物開發(fā)的熱點藥材種類。但目前在云南已瀕臨滅絕，急需對其進行資源保護和人工繁育。該研究在篩選黑蒴不同器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以莖枝為外植體，依次考察了不同基本培養(yǎng)基、不同種類細胞分裂素和質(zhì)量濃度、不同天然有機添加物對定芽(頂芽和側(cè)芽)萌發(fā)增殖及生長的影響。結(jié)果表明：以黑蒴帶節(jié)莖枝為外植體，將其剪成2～3 cm帶節(jié)嫩莖枝，經(jīng)嚴(yán)格的外植物體消毒程序處理后，接種到1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+ Pt 50 g·L-1+ Bn 80 g·L-1+ 25 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂, pH值5.8的培養(yǎng)基上，接種后放置在光照強度1 500～2 000 lx，光照10 h·d-1，溫度22 ℃下培養(yǎng)，接種后8～10 d開始萌發(fā)，40 d單莖平均增殖數(shù)達8.1，主莖40 d生長長度74.2 mm，顯示出極好的誘發(fā)增殖生長效果。該研究結(jié)果初步建立了黑蒴嫰莖枝誘發(fā)定芽及增殖培養(yǎng)體系，為云南珍稀民族藥黑蒴的資源保護、人工栽培和可持續(xù)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

黑蒴， 定芽誘發(fā)， 組織培養(yǎng)， 基本培養(yǎng)基， 細胞分裂素， 天然有機添加物

黑蒴(Melasmaarvense)為玄參科黑蒴屬植物的全草，別名化血膽、紅根草、小化血草等，為名貴苗藥“嘎扎”(丘華興，1996)。其性涼，微苦，具有祛濕，平肝， 清熱利濕；散瘀活血等功效，主要用于治療白血病、心血管病、腫瘤、黃疸型肝炎、肝腫大、跌打傷瘀腫、痛經(jīng)等(國家醫(yī)藥管理局中藥草情報站，1986；中華本草編委會，1999)?，F(xiàn)代藥理研究表明，黑蒴具有瀉下、抗腫瘤作用。從黑蒴根水溶性部分分離的桃葉珊瑚甙對小鼠有瀉下作用，服后6 h起效，其ED50為0.39 g·kg-1，并能促進尿酸排泄(楊仁洲和周俊，1981，1987；楊仁洲等，1983)；從黑蒴根中提取得到的黑蒴甙有抗腫瘤作用，200 mg·kg-1腹腔注射，對小鼠肉瘤白血病L759的抑制率為59.38%(楊仁洲和周俊，1981，1987；楊仁洲等，1983；蘇成業(yè)等，1995)。黑蒴主要分布于云南省南部地區(qū)，為云南省苗族、彝族、拉祜族等民族民間珍稀名貴藥材，被譽“云南最貴草藥”(云南思茅地區(qū)革委會文衛(wèi)組，1971)。云南昆明多家腫瘤醫(yī)院用其治療早期白血病和各類腫瘤；云南省紅河州人民醫(yī)院曾用于治療婦女功能性子宮出血、更年期綜合癥、產(chǎn)后流血過多和腹部包塊等癥；民族民間醫(yī)生用其泡水、泡酒已達到降血壓、降血脂、溶血栓、殺菌、防腫瘤等目的。

黑蒴是云南傳統(tǒng)珍稀名貴藥材，2011年項目組成員到文山西街、屏邊、普洱、瑞麗等地的野生藥材交易早市進行黑蒴民間用藥、資源特點等調(diào)查和搜尋發(fā)現(xiàn)，該植物屬我省極小名貴珍稀物種，具有可開發(fā)為治療早期白血病、各類腫瘤和化血、溶血(死血、於血、血栓)特效藥的巨大潛力；現(xiàn)瀕臨滅絕，偶然見到單株賣價超過200元，鮮品全草每公斤已超過8 000元，目前處于極度珍稀、瀕臨滅絕；產(chǎn)品屬于有價無貨的狀態(tài)，急需對其進行資源保護和人工規(guī)?；N植。目前除本人申請黑蒴組培、煉苗及種子引發(fā)的專利外，國內(nèi)外還未見到任何有關(guān)人工種植的相關(guān)報道(李育川等，2012a,b,c)。本研究在考察黑蒴不同器官為外植體，開展接種誘發(fā)定芽(頂芽和側(cè)芽)的基礎(chǔ)上，以嫰莖枝為接種材料，系統(tǒng)研究黑蒴嫰莖枝誘發(fā)定芽的培養(yǎng)基配方，初步建立起黑蒴莖枝誘發(fā)定芽增殖的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試野生全株及種子于2011年采自云南河口縣蓮花灘，經(jīng)昆明學(xué)院李育川教授鑒定為黑蒴 (Melasmaarvense)的植株及種子。

1.2 培養(yǎng)基制備及滅菌

制備的培養(yǎng)基分別添加瓊脂 6.5 g·L-1和蔗糖25 g·L-1， pH 5.8， 經(jīng)121 ℃高溫滅菌20 min，培養(yǎng)溫度為(22±2)℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為10 h·d-1。

1.3 接種材料的預(yù)處理

將野外采集回來的帶土全株，移植到溫室內(nèi)培養(yǎng)，移植成活后分別剪取根莖、葉片和休眠芽，用毛筆在流水下輕輕刷洗干凈，再經(jīng)飽和洗衣粉溶液清洗 3 次， 流水沖洗 2 h后，移至超凈工作臺上進行外植體的消毒處理。

將采集所得種子用濾紙包扎，先放入水中浸泡5 h，然后轉(zhuǎn)入0.03%的高錳酸鉀溶液浸種2 h，流水沖洗 2 h后，移至超凈工作臺上進行外植體的消毒處理。

1.4 嫩莖枝的獲得

將采獲的黑蒴種子用紗布包好，放入0.03%的高錳酸鉀溶液浸種2 h，參照本人特殊種子引發(fā)處理后(李育川等，2013)，用無菌水漂洗2次后， 拌細砂后播于經(jīng)消毒后的基質(zhì)中，將播種后的花盆置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度22 ℃，光照強度 2 000 lx，光照時間 10 h·d-1)，定期查看水分情況和幼苗生長情況，培養(yǎng)9個月后，待幼苗長3～4 cm后苗剪取生長旺盛的嫩莖枝為接種材料備用。

1.5 外植體的消毒處理

將各種材料用飽和洗衣粉溶液清洗 3 次，剪除葉片，保留完整莖芽，再經(jīng)飽和洗衣粉溶液清洗 3 次， 流水沖洗 2 h。 移至超凈工作臺，采取用75%乙醇浸泡5～8 s，快速取出后用無菌水清洗2次，再放入2%次氯酸鈉溶液(含數(shù)滴聚山梨酯-80)中浸泡20 min，無菌水沖洗 4～5 次，吸干水分，接入待接培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察。

1.6 嫰莖芽外植體直接誘發(fā)側(cè)芽和頂芽

剪取黑蒴幼苗生長旺盛的嫩莖枝，將其進行嚴(yán)格的清洗和一系列外植體消毒處理后，將其剪成帶1～2個節(jié)的帶芽莖段進行接種培養(yǎng)。每處理接種10瓶，每瓶接種3個2～3 cm帶2個節(jié)的帶芽莖段，每處理接種30個外植體，均重復(fù)3次。外植體接種后，觀察定芽誘導(dǎo)情況(萌芽時間，生長情況)，接種3個月后將接種莖段從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈培養(yǎng)基后，統(tǒng)計萌芽數(shù)(芽長0.5 cm以下不計入)并測量芽的長度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所得數(shù)據(jù)用 Excel 和方差分析軟件處理。萌芽數(shù)=接種后成活的外植體出平均誘導(dǎo)出芽的數(shù)量(芽長0.5 cm以下不計入)；芽萌發(fā)率=萌發(fā)芽的外植體總數(shù)/接種成活的外植體總數(shù)；40 d單莖平均增殖數(shù)=40 d形成的定芽總數(shù)/接種的成活外植體總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種器官對定芽(頂芽和側(cè)芽)誘發(fā)

分別采用黑蒴的葉片、休眠芽、根、帶節(jié)嫩莖枝、果實未開裂的成熟種子、未成熟種子為外植體。各種外植體采取用75%乙醇浸泡5～8 s，快速取出后先用無菌水清洗2次，再放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡8～20 min，取出后用無菌水清洗3次，然后接種于MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ Pt 130 g·L-1+25 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂,pH值5.8的培養(yǎng)基上；每處理接種10瓶，葉、芽、根和莖枝每瓶接種3個，種子每瓶按100粒；接種后的材料在光照強度1 500～2 000 lx、光照8 h·d-1、溫度22 ℃下培養(yǎng)，觀察比較各處理的芽萌發(fā)時間，40 d時取出萌發(fā)芽頭，測量萌發(fā)情況和主芽長度。

各接種材料經(jīng)嚴(yán)格的外植體消毒程序處理后進行接種，培養(yǎng)10 d以后，陸續(xù)可見到接種材料萌發(fā)或逐漸死亡。其中，嫩莖枝培養(yǎng)10 d后切口基部開始膨大形成少量紅黃色愈傷組織，芽開始萌發(fā)并分枝和生長；休眠芽則未形成愈傷組織，接種材料基本沒變化，30 d后芽(頂芽和側(cè)芽)開始萌動生長，但生長非常緩慢，芽稍變褐逐漸壞死；無菌播種的種子污染率極高，開裂成熟的種子接種成功率極低，接種20 d以后陸續(xù)開始萌發(fā)，但只能見到2片黃綠色的小子葉，小子葉出現(xiàn)后基本不生長，也不會長根，40 d以后逐漸死亡；肉質(zhì)根接種20 d后前期出現(xiàn)少量紅黃色愈傷組織，后期愈傷組織變褐死亡；葉片和未成熟種子接種后，未見萌發(fā)和愈傷組織生長，材料20 d以后逐漸壞死，未能誘導(dǎo)成功。

由表1可知，處理4以黑蒴嫩莖芽作為外植體培養(yǎng)效果最好，表現(xiàn)為萌發(fā)時間最短，萌發(fā)數(shù)量最多，萌發(fā)率達87.56%；40 d萌發(fā)的主芽長達20.4 mm；休眠芽和成熟種子雖然能萌發(fā)，但表現(xiàn)為萌發(fā)速度較慢、萌發(fā)率較低、萌發(fā)后芽的生長速度較慢，芽稍逐漸變褐后壞死亡；葉片、根和未成熟種子都未萌發(fā)；各處理有顯著差異。這表明黑蒴嫩莖枝可作為外植體接種的理想材料。

表 1 不同器官培養(yǎng)對定芽誘發(fā)的影響

注： 小寫字母表示處理間在 0.05 水平上差異顯著。下同。

Note: Lowercase letters mean significant differences at 0.05 level among treatments. The same below.

2.2 基本培養(yǎng)基對定芽的誘發(fā)增殖

以黑蒴2～3 cm帶2個節(jié)嫩莖枝為外植體，經(jīng)嚴(yán)格的處植物體消毒程序后接種，選擇不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、B5)和不同6-BA質(zhì)量濃度(1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)組合培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在各處理中都添加相同的 Pt 130 g·L-1+ 25 g·L-1蔗糖 + 6 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種10瓶，每瓶接種3個2～3 cm帶芽嫩莖枝，每處理接種 30 個外植體， 均重復(fù) 3 次。接種后的材料在光照強度1 500～2 000 lx，光照10 h·d-1，溫度22 ℃下培養(yǎng)，觀察比較各處理的萌發(fā)時間，40 d時取出叢生芽，測量萌發(fā)情況和主莖長度。

由表2可見，各處理差異著；處理3結(jié)果最佳，表現(xiàn)為接種后7 d后開始萌發(fā)，同時萌發(fā)后的莖枝節(jié)上腋芽開始萌動側(cè)枝，40 d單莖平均增殖數(shù)為4.2個，接種40 d后主枝平均長達36.5 mm，誘發(fā)和增殖生長明顯；其次為處理1和處理5，雖然能萌發(fā)，但與處理3相比，其40 d單莖增殖數(shù)和主莖生長度顯著低于處理3，表現(xiàn)為萌發(fā)時間延遲，同時萌發(fā)芽數(shù)量較少，新芽生長速度慢，增殖不明顯；處理4表現(xiàn)為前期快速萌發(fā)，芽分化數(shù)量爆發(fā)，芽生長緩慢不能生長成有效芽，后期萌芽稍逐漸變褐并枯死；處理2和處理6則未能萌發(fā)，接種后的莖枝葉逐漸萎縮卷曲脫落，芽稍變褐枯死。研究結(jié)果表明1/2MS可作為黑蒴嫩莖枝誘發(fā)增殖定芽培養(yǎng)較理想的基本培養(yǎng)基。

表 2 不同基本培養(yǎng)基對定芽誘發(fā)的影響

表 3 不同細胞分裂素對定芽增殖的影響

2.3 定芽增殖

以黑蒴2～3 cm帶節(jié)嫩莖枝為外植體，經(jīng)嚴(yán)格的處植物體消毒程序后接種，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，選擇3種不同的細胞分裂素種類(6-BA、KT、ZT)，3種不同濃度(1.5、1.0、0.5 mg·L-1)進行培養(yǎng)。在各處理中， 都添加相同的Pt 130 g·L-1+ 25 g·L-1蔗糖 + 6 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種10瓶，每瓶接種3個2～3 cm帶節(jié)嫩莖段，每處理接種 30 個外植體，均重復(fù)3次。接種后的材料在光照強度1 500～2 000 lx、光照10 h·d-1、溫度22 ℃下培養(yǎng)，觀察比較各處理的萌發(fā)時間，40 d時取出叢生芽，測量萌發(fā)情況和主莖生長長度。

表 4 不同天然有機添加物對定芽誘發(fā)增殖的影響

圖 1 黑蒴定芽誘發(fā)增殖 A. 接種10 d后定芽萌發(fā)； B. 接種20 d后定芽生長； C. 接種30 d后定芽增殖； D. 黑蒴生根苗。Fig. 1 Adventitious bud induction and multiplication of Melasma arvense A. Bud germination after inoculation with 10 d; B. Growth of adventitious buds after inoculatin with 20 d; C. Proliferation of adventitious buds after inoculation with 30 d; D. Melasma arvense rooting seedlings.

通過比較發(fā)現(xiàn)各處理差異著；處理1萌發(fā)增殖效果最佳，表現(xiàn)為接種后8～10 d開始萌發(fā)，同時萌發(fā)后的莖枝節(jié)上腋芽開始萌動側(cè)枝，接種40 d單莖萌發(fā)數(shù)可達6.3個，接種40 d主枝平均生長長度達68.2 mm，增殖和主莖生長顯著高于其它處理，表現(xiàn)出較好的增殖和生長效果；其次為處理2、處理4和處理7，也表現(xiàn)出較好萌發(fā)增殖和主莖生長效果，但與處理1相比，同時平均萌發(fā)數(shù)量減少，新芽生長速度減慢；其余各處理萌發(fā)增殖效果較差。研究結(jié)果表明黑蒴帶節(jié)嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基配方中最佳的細胞分裂素種類為6-BA,其較適宜的濃度為0.5 mg·L-1。

2.4 天然有機物添加物對定芽增殖的影響

以2～3 cm帶節(jié)嫰莖枝為接種材料，選擇5種不同天然有機添加物種類(椰子汁、香蕉泥、馬鈴薯汁、蘋果汁、香蕉泥馬鈴薯汁混合)進行培養(yǎng)，每種有機添加物的量為130 g·L-1。在各處理中都添加相同的1/2 MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ 25 g·L-1蔗糖 + 8 g·L-1瓊脂, pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種6個材料；接種后的材料在光照強度1 500～2 000 lx，光照10 h·d-1，溫度22 ℃下培養(yǎng)，觀察比較各處理的萌發(fā)時間，40 d時取出叢生芽，測量萌發(fā)情況和主莖長度。

通過比較發(fā)現(xiàn)，處理1和4萌發(fā)增殖效果最佳，表現(xiàn)為接種8 d后就開始萌發(fā)，接種單莖萌發(fā)數(shù)分別為8.3個和8.1個，接種20 d主枝平均長度達75.0 mm、74.2 mm，側(cè)枝增殖非常明顯，葉色濃綠，生長旺盛，二者無顯著差異；其次為處理2，也表現(xiàn)出較好萌發(fā)增殖效果，但與處理1、處理4相比，萌發(fā)芽和主枝生長顯著低于處理1和處理4，萌芽數(shù)量減少，側(cè)枝萌發(fā)也不明顯，新芽生長速度減慢；再次為處理3，雖然也表現(xiàn)出一定的萌發(fā)增殖效果，但萌發(fā)數(shù)量和新芽生長速度都減慢，顯著低于處理2；所有處理中，處理5效果最差，說明帶節(jié)嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中添加蘋果，效果不明顯。這表明椰子汁和香蕉+馬鈴薯作為黑蒴嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)的理想天然有機物添加物，但綜合考慮材料來源、價格、成本等因素，選擇香蕉和馬鈴薯混合添加效果最佳。

3 討論與結(jié)論

黑蒴根、葉、種子(成熟、未成熟)、休眠帶芽莖段、嫩莖枝等器官，經(jīng)嚴(yán)格的外植體消毒程序(不同材料稍有變化)處理后進行接種培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，陸續(xù)見到接種材料萌發(fā)或逐漸死亡，其中嫩莖枝培養(yǎng)10 d后切口基部開始膨大形成少量紅黃色愈傷組織，嫩莖芽開始萌發(fā)并開始分枝和生長，而其它器官則未培養(yǎng)成功，這可能是本實驗室中設(shè)計的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件較適宜生長旺盛的莖芽培養(yǎng)，而不適宜其它器官的培養(yǎng)。同一種植物不同器官的培養(yǎng)效果，會因接種材料本身的性質(zhì)(老嫩程度、休眠與萌動等)、培養(yǎng)基配方(基本培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度、有機添加物等)、培養(yǎng)條件(光照時間、光照強度、培養(yǎng)溫度等)等綜合作用，產(chǎn)生不同的培養(yǎng)效果響應(yīng)(李育川等，2012a,b,c)，因此，黑蒴根、葉、種子(成熟、未成熟)、休眠帶芽莖段等其它器官的組織培養(yǎng)方法有待深入研究。如利用果實未開裂的新鮮種子(成熟、未成熟)進行無菌培養(yǎng)，具有可能植株分化容易、無菌操作方便、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(王蒂和陳勁楓，2013)，是實現(xiàn)大量生產(chǎn)黑蒴試管苗的好材料；在實驗中發(fā)現(xiàn)，利用肉質(zhì)根或莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)出大量的愈傷組織，且愈傷組織呈紅色，民族醫(yī)生判斷黑蒴的藥效好壞，就主要看根紅不紅，其愈傷組織中可能含有大量桃葉珊瑚甙、黑蒴甙等活性物質(zhì)。從愈傷組織培養(yǎng)物中尋找活性成分已有報道(劉群等，2015；李琰等，2015)。通過深入研究黑蒴愈傷組織誘導(dǎo)增殖及活性成分的產(chǎn)生問題，將其愈傷組織直接入藥或從中提取分離桃葉珊瑚甙、黑蒴甙等主要活性物質(zhì)也具有巨大應(yīng)用前景。

以黑蒴2～3 cm帶節(jié)嫩莖枝為外植體，選擇不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、B5)和不同6-BA濃度(1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)組合培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用1/2 MS + 6-BA 1.0 mg·L-1的組合最好；采用MS(B5) + 6-BA 1.0 mg·L-1的組合也能生長但生長效果較差，表現(xiàn)為前期芽爆發(fā)，后期芽稍逐漸變褐并枯死；1/2 MS + 6-BA 2.0 mg·L-1表現(xiàn)為前期快速萌發(fā)，表現(xiàn)為前期芽分化數(shù)量爆發(fā)，但不會生長成有效芽，后期芽稍逐漸變褐并枯死；MS(B5) + 6-BA 2.0 mg·L-1則完全不能萌發(fā)，接種后的莖枝葉逐漸萎縮卷曲脫落，芽稍變褐枯死。出現(xiàn)以上結(jié)果可能是黑蒴對培養(yǎng)基中的無機鹽和離子濃度要求均較低且對細胞分裂素類物質(zhì)也比較敏感，其培養(yǎng)基可能要求較低無機鹽和離子濃度，當(dāng)無機鹽和離子濃度較高時會抑制叢生芽的生長甚至?xí)a(chǎn)生毒害作用(李育川等，2012a,b,c)。因此，黑蒴嫰莖枝誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基可能應(yīng)用1/2MS或White培養(yǎng)基等含無機鹽和離子濃度較低的基本培養(yǎng)基生長較為理想，具體情況還有待進一步研究。

以黑蒴嫩莖枝為外植體，接種到1/2MS基本培養(yǎng)基上，選擇3種不同的細胞分裂素種類(6-BA、KT、ZT)和3種不同質(zhì)量濃度(1.5、1.0、0.5 mg·L-1)進行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一種細胞分裂素間，增殖和生長效果0.5 mg·L-1> 1.0 mg·L-1> 1.5 mg·L-1,顯示出當(dāng)添加的細胞分裂素0.5～0.5 mg·L-1時，較低濃度的增殖生長效果好于較高濃度，說明黑蒴嫰莖枝定芽誘發(fā)培養(yǎng)對細胞分裂素類物質(zhì)比較敏感，其培養(yǎng)基添加較低濃度細胞分裂素(小于2.0 mg·L-1)有利用其增殖和生長，當(dāng)細胞分裂素的濃度較高時會抑制叢生芽的生長，這與朱麗芳等老鴉瓣芽莖誘導(dǎo)叢生芽的報道具有相似性(朱麗芳等，2014)；在實驗培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-16-BA的處理，其誘發(fā)增殖和生長效果顯著高于其它處理，這說明不同的細胞分裂素種類和濃度對黑蒴嫩莖枝增殖生長的響應(yīng)不同，對于各種細胞分裂素的應(yīng)用效果及合理添加濃度，還有待于進一步縮小各類細胞分裂素的濃度梯度設(shè)置的實驗。

以黑蒴嫰莖枝為接種材料，選擇添加5種不同天然有機添加物(椰子汁、香蕉泥、馬鈴薯汁、蘋果汁、香蕉泥馬鈴薯汁混合)進行培養(yǎng)，結(jié)果顯示不同的天然有機添加物對黑蒴嫰莖枝的定芽誘發(fā)增殖和生長響應(yīng)不同，其結(jié)果是添加椰子汁和香蕉+馬鈴薯混合液的增殖和生長效果顯著優(yōu)于其它添加物，這可能是因不同的有機添加物所含營養(yǎng)成分(促進或抑制生長物質(zhì))種類和濃度不相同，同時添加的天然有機物質(zhì)還會對培養(yǎng)基中的無機鹽、離子濃度、膠體穩(wěn)定性、溶液緩沖性等多因素造成影響(王蒂和陳勁楓，2013)，從而對黑蒴嫰莖枝定芽的誘發(fā)、增殖生長影響不同，具體影響機理還有待研究。

本研究以黑蒴帶節(jié)嫩莖枝為外植體，將其剪成2～3 cm帶2個節(jié)嫩莖枝，經(jīng)飽和洗衣粉溶液清洗 3 次，流水沖洗2 h，移至超凈工作臺，采取用75%乙醇浸泡5～8 s，快速取出后用無菌水清洗2次，再放入2%次氯酸鈉溶液(含數(shù)滴聚山梨酯-80)中浸泡20 min，無菌水沖洗 4～5 次，用無菌紙吸干水分后，接種到1/2 MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ Pt 50 g·L-1+ Bn 80 g·L-1+ 25 g·L-1蔗糖 + 7 g·L瓊脂，pH值5.8的培養(yǎng)基上，接種后的放置在光照強度1 500～2 000 lx，光照10 h·d-1，溫度22 ℃下培養(yǎng)，接種后8～10 d就開始萌發(fā)，主莖快速生長，同時側(cè)枝大量萌發(fā)，生長旺盛，葉色濃綠，單莖40 d平均增殖數(shù)超過8個以上，主莖40 d生長長度超過7.5 cm，顯示出很好的增殖效果。

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Adventitious bud induction and multiplication ofMelasmaarvense

LI Yu-Chuan1, FANG Hai-Ling2, WANG Ding-Kang1, XIANG Xiao-Dong3,JIN Song1, GENG Kai-You1*

( 1. Kunming University, kunming 650214, China; 2. Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014,China;DaliPolytechnicCollegeofAgricultureandForestry, Dali 671003, Yunnan, China )

Melasmaarvenseis known as one of the precious herbs in Yunnan Province, and has the effects on leukemia, cancer, dispersing blood stasis and hemolysis. It has become a hot spot for the development of natural drugs in Yunnan. At present, because of its peculiar habitat, seed dispersal difficulty, reproductive barriers, seed germination and establishment difficulty and over-harvesting, wild plants are becoming extinctive recent years in Yunnan Province. Therefore, in order to realize resource protection and restoration, it is necessary to carry out resource conservation and artificial breeding. In order to primary establish the adventitious bud induction and multiplication system that present excellent properties of growth and multiplication, used stem shoots as tissue culture inoculation materials studied the effects of different medium type, different concentrations of cytokinin and different natural organic additives on bud multiplication and growth based on the prophase research of provenance collection, artificial propagation and screening of different organ culture ofM.arvense. The results indicated that about 2-3 cm long stem with buds cultured on cultural conditions(1/2 MS with 6-BA 0.5 mg·L-1+ Pt 50 g·L-1+ Bn 80 g·L-1+ 25 g·L-1sugar + 7 g·L-1agar with pH=5.8, a temperature of 22 ℃, light 10 h·d-1) for 8-10 d, they produced numerous adventitious buds. Each explant produced 8.1 shoots and the grow length of main stem was 74.2 mm in 40 d. The experiment primarily established the adventitious bud induction and multiplication system that present excellent properties of growth and multiplication. This study provides a scientific basis for the artificial cultivation and sustainable use.

Melasmaarvense, induction of adventitious bud, tissue culture, basic medium, cytokinin, natural organic additives

10.11931/guihaia.gxzw201512029

2015-12-29

2016-02-11

云南省高校優(yōu)勢特色重點學(xué)科建設(shè)項目(生態(tài)學(xué))；昆明學(xué)院人才引進項目(YJL11027)[Supported by Key Disciplines Project of Yunnan Education Department (Ecology); Kunming University of Talent Introduction Project(YJL11027)]。

李育川(1972-)，男(彝族)，云南永仁人，教授，博士，主要從事藥用植物資源利用與評價，(E-mail)lychuan72@163.com。

*通訊作者： 耿開友，副教授，主要從事植物組織培養(yǎng)教學(xué)和研究， (E-mail)Lyc99326@126.com。

Q943.1

A

1000-3142(2016)12-1432-07

李育川， 房海靈， 王定康， 等. 黑蒴定芽誘發(fā)增殖的初步研究 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1432-1438

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