冬凌草甲素增強吉西他濱對胰腺癌Panc-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用

劉殿雷 卜賀啟 趙金鋒 黃海?

冬凌草甲素增強吉西他濱對胰腺癌Panc-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用

劉殿雷 卜賀啟 趙金鋒 黃海?

目的探討冬凌草甲素在體內(nèi)增強吉西他濱對胰腺癌Panc-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其可能的作用機制。方法 建立胰腺癌Panc-1細(xì)胞株的裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分為對照組（Control）、吉西他濱組（Gemcitabine）、冬凌草甲素組（Oridonin）以及冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱組（Gem+Ori），每組各10只，各組均采用腹腔注射給藥，1次/3d，共10次。實驗過程中測量腫瘤體積并稱量裸鼠體重。免疫組織化學(xué)染色法觀察腫瘤組織中p38和p53表達(dá)的變化，Tunel法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果與其它各組比較，冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱組對Panc-1細(xì)胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用；末次用藥1周后聯(lián)合組腫瘤體積和質(zhì)量明顯小于其他各組（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱組的p38和p53蛋白表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）；Tunel檢測結(jié)果顯示聯(lián)合組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多。結(jié)論冬凌草甲素可協(xié)調(diào)增強吉西他濱對胰腺癌Panc-1細(xì)胞移植瘤的抑瘤作用，其機制可能是通過上調(diào)p38及其下游p53的表達(dá)而實現(xiàn)。

冬凌草甲素 胰腺癌 吉西他濱 p38 p53

冬凌草甲素是從唇形科Labtea香茶菜屬Rabdosi提取的一種二萜類化合物，相關(guān)實驗已報道它有各種藥理學(xué)和生理學(xué)效應(yīng)例如抗炎，抗菌，抗腫瘤作用［1］。關(guān)于其抗腫瘤活性，研究已經(jīng)證實冬凌草甲素對一些腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生顯著的抑制效應(yīng)及細(xì)胞毒性作用［2-3］。近年來，較多實驗研究表明化療藥物的聯(lián)合比單個藥物成分可更有效提高化療效果，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)；其中，中藥單體聯(lián)合化療藥物治療腫瘤也是目前研究的熱點之一［4］。本實驗在裸鼠移植瘤模型基礎(chǔ)上研究冬凌草甲素協(xié)調(diào)增強胰腺癌吉西他濱化療敏感性，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 冬凌草甲素（純度＞98%），購于北京環(huán)宇生物技術(shù)有限公司，用DMSO配制成10mmol/L（DMSO的終濃度＜0.1%），-20℃冰箱保存；吉西他濱（法國禮來公司）用無菌生理鹽水配成0.2 m mol/L；胎牛血清（四季青公司）、胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；兔抗人p38抗體和p53抗體（美國Epitomics公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞Panc-1（購于ATCC）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液1次。細(xì)胞單層貼壁生長，至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3 實驗動物 4～6周齡健康雌性裸鼠購于中科院上海實驗動物中心，體重20～22g，飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)（無特定病原體級），室溫控制在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。

1.4 模型建立、分組及給藥方法 將（5～10）×106個處于對數(shù)生長期的Panc-1細(xì)胞懸浮于0.2ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，注射到裸鼠背部靠近右側(cè)后肢皮下，建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型。接種4周后，待移植瘤體積長至100～150mm3，將荷瘤裸鼠隨機分為4組：對照組（N組，生理鹽水）、吉西他濱組（G組，80mg/kg）、冬凌草甲素組（O組，40mg/kg）、聯(lián)合組（G+O組，吉西他濱 80mg/kg；冬凌草甲素40mg/kg），每組各10只。分組當(dāng)天開始腹腔注射給藥，藥物注射的最終體積為0.2ml/只，1次/3d，共9次。末次用藥1周后處死裸鼠。分組當(dāng)天即用游標(biāo)卡尺監(jiān)測腫瘤體積（V）：V=π/6×a×b2，其中a、b分別為垂直方向的腫瘤最大和最小徑線［5］，以后每隔5d稱量各組裸鼠體重并測量移植瘤長徑和短徑一次，處死裸鼠前稱量裸鼠體重和腫瘤長短徑，前后共測量7次裸鼠體重和瘤體大小。繪制各組荷瘤裸鼠的平均體重及移植瘤平均體積隨用藥時間點變化曲線。末次用藥1周后用10%水合氯醛麻醉裸鼠，取腫瘤組織稱量。取部分組織用4%多基甲醛固定，石蠟切片后做免疫組化染色。另一部分保存于液氮中備用。

1.5 Tunel法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡 取出制備好的石蠟切片。對各組標(biāo)本的同一橫截面進行連續(xù)切片，所得石蠟切片進行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，按照Tunel試劑盒所示的操作步驟進行操作；在高倍鏡（OLYMPUS BX51，400×）隨機選擇10個視野，Image-pro plus 6（Ipp-6）軟件分析平均光密度。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中p38和p53表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫臘水化，0.3%H2O2封閉，微波抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10min；兔抗人P38抗體（稀釋度1∶300），P53 抗體（稀釋度1∶500），4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記的二抗37℃ 30min 時，DAB 顯色3～5min，沖洗后蘇木素復(fù)染，流水沖洗返藍(lán)后脫水封。圖片結(jié)果用Ipp-6圖像處理軟件進行分析平均光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）的形式表示，進行方差分析，均數(shù)之間的多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對荷瘤裸鼠體重的影響 各組荷瘤裸鼠在實驗開始時體重（g）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分別為對照組（26.04±1.38）g、吉西他濱組（25.85±2.01）g，冬凌草甲素組（24.98±1.58）g和聯(lián)合組（25.71±1.75）g。實驗結(jié)束時各組荷瘤裸鼠體重：冬凌草甲素組（21.93±1.67）g、NS組（18.64±1.86）g、吉西他濱組（13.45±1.18）g、聯(lián)合組（16.86±1.93）g。實驗結(jié)果顯示，冬凌草甲素組體重降低最少，其次為對照組，吉西他濱組體重降低最為明顯。

2.2 各組腫瘤體積、質(zhì)量變化 裸鼠隨機分組當(dāng)天各組的腫瘤平均體積為（132.14±12.62）mm3，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。末次用藥后1周，瘤體平均體積對照組為（615.48±102.31）mm3，冬凌草甲素組為（362.34±36.47）mm3，吉西他濱組為（332.14±42.16）mm3，聯(lián)合組為（217.68±37.24）mm3。與對照組比較，冬凌草甲素組與吉西他濱組的瘤體平均體積與質(zhì)量均明顯小于對照組（P＜0.05），但聯(lián)合組的變化更為明顯，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 冬凌草甲素增強吉西他濱的抑瘤作用

2.3 Tunel法檢測各組瘤體細(xì)胞的凋亡情況 Tunel染色后陽性細(xì)胞的鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞核染成棕褐色，胞核固縮，染色質(zhì)濃縮，而胞漿不著色；圖片經(jīng)Imagepro plus 6軟件處理分析后，陽性細(xì)胞比例采用累積吸光值（IOD）表示，吸光值越大表明凋亡細(xì)胞數(shù)越多；實驗結(jié)果顯示（見圖1）：與對照組IOD值（32.7±2.76）相比較，冬凌草甲素組IOD值（82.1±6.46），吉西他濱組IOD值（97.4±7.62），聯(lián)合組IOD值（216.3±12.27），均有明顯增加，且均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；尤以聯(lián)合組增加更明顯。

圖1 各實驗組藥物處理后Tunel法檢測瘤體細(xì)胞凋亡

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中p38和p53表達(dá) Image-pro plus 6軟件分析腫瘤組織中p38和p53的表達(dá)平均光密度，與對照組相比較，吉西他濱或冬凌草甲素單獨可上調(diào)腫瘤組織中p38和p53的表達(dá)（P＜0.05）；而聯(lián)合組能顯著上調(diào)p38和p53在腫瘤組織中的表達(dá)，與其他各組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 各實驗組藥物處理后免疫組化法檢測瘤體內(nèi)p38和p53蛋白的變化

3 討論

胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后很差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在美國，胰腺癌年死亡人數(shù)為39.590例，位居美國因惡性腫瘤病死率的第四位［6］；2008年中國腫瘤登記地區(qū)的胰腺癌發(fā)病占全部癌癥的2.86%，位居第7位，死亡占全部癌癥4.09%，位居第6位［7］；且病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。吉西他濱是目前治療進展期胰腺癌最好的一線化療藥物，但在長期的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由于胰腺癌細(xì)胞獲得性及內(nèi)在的耐藥性、早轉(zhuǎn)移性等因素，吉西他濱治療胰腺癌的效果并不理想，總有效率＜20%［8］。因此，尋求一種安全有效的方法增強胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，增加吉西他濱的療效顯得尤為重要。

國內(nèi)外研究已證實冬凌草甲素不僅在體內(nèi)外對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制效應(yīng)，而且發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用時可以增強腫瘤細(xì)胞對其他抗腫瘤藥物的敏感性。BU等對一項關(guān)于冬凌草甲素的體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過激活p38-MAPK信號通路上調(diào)p38及其下游的p53的表達(dá)來促進胰腺癌細(xì)胞的凋亡，并可通過阻止細(xì)胞周期的進展抑制其增殖的發(fā)生［9］。本資料結(jié)果顯示，各組荷瘤裸鼠在實驗開始時體重相比無明顯差別，但實驗結(jié)束時與對照組比較，冬凌草甲素組體重略微增加，聯(lián)合組體重略微降低，吉西他濱組體重降低較為明顯，且吉西他濱組荷瘤裸鼠體重與其他組相比有顯著性差異，提示冬凌草甲素作為一種可能的胰腺癌抗腫瘤藥物不僅能促進吉西他濱對胰腺癌Panc-1裸鼠移植瘤的凋亡，且提示在該治療濃度范圍內(nèi)對裸鼠無明顯的毒性作用。本資料干預(yù)結(jié)束后剝?nèi)「鹘M動物的瘤塊進行比較，單藥組移植瘤體積與質(zhì)量均明顯小于對照組移植瘤體積，其中聯(lián)合組移植瘤體積與質(zhì)量較其他各組顯著減少，且聯(lián)合組抑瘤率較單藥組較為明顯。另外實驗過程中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組移植瘤體積呈逐漸縮小趨勢。提示冬凌草甲素可增強吉西他濱對Panc-1細(xì)胞移植瘤的生長抑制作用。

絲裂原蛋白激酶是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有研究證明，它是存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的一類重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶類，可將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)，影響基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。目前已確定出3條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而p38-MAPK則是介導(dǎo)細(xì)胞因子及應(yīng)急刺激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、分化及炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［10］。已有研究證實p38MAPK信號通路參與胰腺癌細(xì)胞的凋亡過程［11-12］。p38-MAPK激活后可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，其中包括腫瘤抑制因子p53［13］。且有文獻(xiàn)報道p38-MAPK通路的激活可導(dǎo)致p53誘導(dǎo)的凋亡［14］。p53是凋亡過程中一個重要調(diào)控因子，在維持細(xì)胞正常生長、抑制惡性增殖過程中起著重要作用。p53作為一個轉(zhuǎn)錄因子對DNA損傷做出反應(yīng)，并誘導(dǎo)下游蛋白如p21、Mdm2和Bax的表達(dá)，這些下游蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡［15］。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，冬凌草甲素和吉西他濱單藥組或聯(lián)合組移植瘤組織中p38蛋白與p53蛋白均呈高表達(dá)，且聯(lián)合組表達(dá)最為顯著，提示p38-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活促進其下游p53的表達(dá)，從而引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制移植瘤的生長。

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ObjectiveThis study investigated oridonin enhanced the effects of gemcitabine against pancreatic cancer in nude-mouse transplanted tumor model as well as its mechanism of action.MethodsTo establish a pancreatic cancer nude-mouse transplanted tumor model；2. To set three groups which are control，gemicitabine，oridonim and Gem+Ori，respectively；3. To treat the mouse with intraperitoneal injection，once per 3 days，10 times totally；4. To weigh the tumor and the mouse；5. To compare the change of P38 and p53 using immunohistochemical analysis and TUNEL for cell apoptosis. Result We found that Oridonin can enhance the anti-tumor activity of Gemcitabine in pancreatic cancer nude-mouse transplanted tumor model. TheResultsindicated that：1. The volume and weight of the tumor was dramatic decreased after treatment of Oridonin；The expression of p38 and p53 were all increased（P＜0.05）；Apoptosis rate was higher in the group treated with both Gemcitabine and Oridonin than other groups.ConclusionOridonin could enhance the anti-tumor activity of Gemcitabine though up-regulate p38 and p53.

Oridonin Pancreatic cancer Gemcitabine P38 P53

浙江省中醫(yī)藥管理局優(yōu)秀青年基金項目(2013ZQ026)；杭州市科技發(fā)展計劃項目(20140733Q34，20130633B19)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生研究計劃(2013KYA169)；國家自然科學(xué)青年基金項目(81202821)

310007 杭州市中醫(yī)院外一科（劉殿雷 趙金鋒 黃海）310012 浙江省立同德醫(yī)院肛腸科（卜賀啟）*通信作者