有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)功能的影響

劉倩倩，秦 智，侯改霞，習(xí)雪峰，肖國(guó)強(qiáng)

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)功能的影響

劉倩倩1，秦 智2，侯改霞1，習(xí)雪峰1，肖國(guó)強(qiáng)3

目的：觀察8周60 min/天的游泳訓(xùn)練對(duì)NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)異常蓄積、細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂的改善作用。方法：3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠35只，隨機(jī)分為正常對(duì)照(C組，9只)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食；高脂組(26只)，高脂飼料喂食，構(gòu)建NAFLD模型：分為高脂對(duì)照組(FC組，13只)和高脂運(yùn)動(dòng)組(FE組，13只)。采用無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練，每周運(yùn)動(dòng)6天，休息1天，持續(xù)8周。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，測(cè)定肝指數(shù)、血脂水平、肝組織切片、電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)，ORT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物3(SOCS3)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP1c)等mRNA水平。結(jié)果：與C組相比，F(xiàn)C組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝脂數(shù)、TC、FFA、SREBP1c、SOCS3 mRNA表達(dá)均出現(xiàn)明顯增加(P<0.01或P<0.05)，HDL-c減少(P<0.05)；FE組與FC組相比，體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝指數(shù)、TC、FFA、SREBP1c、SOCS3 mRNA表達(dá)均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01或P<0.05)；鏡下顯示，C組大鼠肝結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂肪小泡，線粒體嵴豐富齊整；FC組大鼠肝結(jié)構(gòu)紊亂，核畸形，核周水腫，線粒體腫脹，嵴部分排列紊亂或消失，胞內(nèi)脂滴及空泡樣變數(shù)量明顯增多；FE組大鼠肝結(jié)構(gòu)改善，膜結(jié)構(gòu)正常，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)較為明顯。結(jié)論：1)16周高脂飲食NAFLD大鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的肝臟脂質(zhì)異常蓄積，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)畸形。2)規(guī)律的適宜強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)可明顯改善NAFLD大鼠中存在的脂質(zhì)代謝紊亂，可能通過(guò)促進(jìn)肝臟細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能趨于正常，從而減少肝臟這一非脂肪組織的脂肪蓄積，減輕肝臟脂肪變性程度，促進(jìn)非酒精性脂肪肝的良性轉(zhuǎn)歸。關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝；非脂肪組織；肝細(xì)胞；線粒體結(jié)構(gòu)；脂肪變性；大鼠

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是脂肪在肝臟這一非脂肪組織異常蓄積并引起肝組織連續(xù)應(yīng)激的過(guò)程，病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌，其發(fā)病率呈增高[12，27]和低齡化趨勢(shì)[10,19],NAFLD已成為一個(gè)世界性的健康問(wèn)題[14]。肝細(xì)胞線粒體功能障礙在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[7],線粒體是肝細(xì)胞最重要的產(chǎn)能細(xì)胞器，它在細(xì)胞能量產(chǎn)生過(guò)程中扮演重要角色，并整合多個(gè)信號(hào)途徑來(lái)控制細(xì)胞的生命和死亡[17]。線粒體功能障礙使肝臟對(duì)脂質(zhì)異常蓄積這一有害刺激耐受性降低，繼而發(fā)生肝組織脂肪變性，肝臟脂肪變性又反作用于線粒體[13，17]，引起線粒體合成ATP的能力降低，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷信號(hào)通路作用，形成一個(gè)惡性循環(huán)。膳食結(jié)構(gòu)的良性調(diào)整在預(yù)防NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,部分是通過(guò)維持線粒體的功能達(dá)到預(yù)防效果[9]。目前，有關(guān)于運(yùn)動(dòng)改善NAFLD中線粒體功能的研究較少，其具體機(jī)制尚不清楚，本研究旨在通過(guò)觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD中肝細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因的影響，以期為其防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

3月齡SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠35只，體質(zhì)量200±22 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002粵監(jiān)證字2008D007。常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23℃±2℃，自由飲水進(jìn)食。

普通飼料：選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物混合飼料，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料：采購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。高脂飼料具體成分：5%(w/w)蔗糖，18%(w/w)豬油，15%(w/w)蛋黃粉，0.5%(w/w)膽鹽，1%(w/w)膽固醇，60.5%(w/w)基礎(chǔ)飼料。

1.2 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建

適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)抽取10只大鼠，喂食普通飼料，作為正常對(duì)照組(C組);剩余30只喂食高脂高膽固醇飼料，用于制備大鼠NAFLD模型。分組后，正常對(duì)照組大鼠喂食普通飼料，高脂組大鼠喂食高脂飼料。兩組大鼠均不限制飲食和飲水。喂食8周，每周同一時(shí)間記錄大鼠體重，及時(shí)剔除體重顯著性差異的個(gè)體，保持同組別個(gè)體間體重均無(wú)顯著性差異。于造模期的第6、7、8周兩組均宰殺1只大鼠，制備肝組織切片和測(cè)生化指標(biāo)，確定模型進(jìn)度，直至建模成功。建模成功后，高脂模型組大鼠分為高脂對(duì)照組(FC組)和高脂運(yùn)動(dòng)組(FE組)。

依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組頒布的非酒精性脂肪肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，控制本研究動(dòng)物造模質(zhì)量。本研究SD大鼠NAFLD模型診斷標(biāo)準(zhǔn)為：1)血清ALT基本正常；2)肝臟組織學(xué)表現(xiàn)符合非酒精性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)：低倍鏡下視野內(nèi)占肝細(xì)胞總數(shù)30%以上的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，但無(wú)其他明顯組織學(xué)改變。視野內(nèi)30%～50%的肝細(xì)胞脂肪變者為輕度脂肪肝；50%～75%為中度脂肪肝；75%以上為重度脂肪肝。低倍鏡下視野內(nèi)發(fā)生脂肪變的肝細(xì)胞占肝細(xì)胞總數(shù)的比例<30%者稱為肝細(xì)胞脂肪變性。肝組織病理學(xué)切片送兩位執(zhí)業(yè)病理醫(yī)師盲法診斷。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

高脂運(yùn)動(dòng)組大鼠自運(yùn)動(dòng)周期開(kāi)始分別進(jìn)行為期8周的不負(fù)重游泳訓(xùn)練，第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練。第1天運(yùn)動(dòng)時(shí)間為10 min，以后每天遞增10 min，直至游泳時(shí)間增加到60 min，從第2周開(kāi)始維持此運(yùn)動(dòng)時(shí)間至9周結(jié)束。

1.4 取材

運(yùn)動(dòng)周期實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量：0.35～0.40 mL/kg bw)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置、處理，用于血脂指標(biāo)測(cè)試。在大鼠尚存心跳時(shí)，迅速取肝，處理大小為1～2 mm3，1 min之內(nèi)入2.5%～3%戊二醛，4℃保存2～4 h。取大鼠肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定24～48 h，用于制備肝組織病理切片；取部分肝組織，放入液氮保存、待測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，每周固定時(shí)間稱量大鼠體質(zhì)量；2)采用半自動(dòng)生化分析儀Eppendorf ECOM-F 6124(Eppendorf Co.Germany)檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量；3)血清游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)采用比色法；4)肝指數(shù):稱量肝重與體質(zhì)量,計(jì)算肝/體比值,即為肝指數(shù)；5)通過(guò)HE染色制作肝組織病理切片，光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況；6)肝組織電鏡切片，通過(guò)日立H-7650透射電子顯微鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)；7)信使核糖核酸測(cè)定：實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP1c)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1(peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1 )的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 肝組織病理切片

常規(guī)石蠟切片。HE染色，光鏡下觀測(cè)肝組織學(xué)變化。將組織塊選取同一部位進(jìn)行切塊并修塊、脫水、沖水透明后,浸蠟、包埋、切片、撈片、攤片,在60℃干燥箱中過(guò)夜后,進(jìn)行HE染色。

1.7 RT-PCR檢測(cè)方法

取材后，立即進(jìn)行RNA的制備。加入1 mL的Trizol提取總RNA。準(zhǔn)備 1.5 mL 的 EP管，冰上操作：在 EP管中加入0.1～5 μg模板 RNA，1 μL Oligo(dT)18引物， DEPC水定容至12 μL，短暫離心；70℃水浴5 min后，冰上冷凍；短暫離心后，冰上操作：加入 4 μL 5×First-Strand Buffer，1 μL RibolockTM Ribonuclease Inhibitor，2 μL(10 mmol)dNTP mix；短暫離心，37℃水浴5 min，加入1 μL (200 U/μL)ReverAid M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(總反應(yīng)體積20 μL)； 42℃水浴60 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；70℃水浴10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)，再冰上冷凍；立即進(jìn)行qRT-PCR。 qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s,65℃退火15 s,循環(huán)40次。試劑購(gòu)于威佳生物試劑公司。目的基因引物序列如表1所示。GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 肝組織透射電鏡方法

取新鮮肝組織，大小為1～2 mm3，取材的刀片要鋒利，低溫操作，通常為4℃；前固定：1 min之內(nèi)入2.5%～3%戊二醛，4℃，2～4 h。0.1 mol/L PBS漂洗，10 min×2；后固定：1%鋨酸1.5～2 h,0.1 mol/L PBS 漂洗，5 min×2。脫水：50%、70%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)10 min，80%、90%、100%丙酮逐級(jí)脫水，每級(jí)10 min×2。置換：100%丙酮，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋劑以1∶1混合，置換40 min。浸透：環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋劑37℃浸透過(guò)夜。包埋：將組織置包埋模內(nèi)Epon812包埋劑包埋，60℃聚合48 h。在解剖顯微鏡下修塊，將組織表面修平整，暴露組織并根據(jù)組織表面的形狀修成梯形、正方形或長(zhǎng)方形。切半薄切片：在AO超薄切片機(jī)下切1 μm的半薄切片，并置水上展平。HE染色。在解剖顯微鏡下和普通顯微鏡下定位，通常定位后切面為0.09 mm3；超薄切片：在AO超薄切片機(jī)下切40～60 nm的超薄切片，用銅網(wǎng)撈片。電子染色：70%乙醇配制的飽和醋酸鈾染色3 min，雙蒸水漂洗，鉛染液染3 min，雙蒸水漂洗。干燥后電鏡觀察。

表 1 本研究所涉全部QRT-PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 造模期正常對(duì)照組和高脂組大鼠體重的變化

在造模周期內(nèi)，正常對(duì)照組和高脂組SD大鼠的體重均有明顯增加，從適應(yīng)性喂養(yǎng)的300 g左右增加到造模周期結(jié)束時(shí)的580 g左右，但兩組大鼠體重增加的幅度并不一致，具體數(shù)據(jù)如表2。

表 2 造模期間大鼠體重變化

注：與正常對(duì)照組大鼠適就周比較，##表示P<0.01；與高脂組大鼠適應(yīng)周比較，**表示P<0.01；與正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)周比較，§ 表示P<0.05，§§表示P<0.01。

在適應(yīng)性喂養(yǎng)的1周內(nèi)，兩組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，進(jìn)入造模周期后，兩組大鼠體重較適應(yīng)周均有明顯增長(zhǎng)，從造模第1周就呈非常著性差異(P<0.01)，此趨勢(shì)一直持續(xù)至建模期第8周。同時(shí)，造模期第1周，高脂組大鼠體重與正常對(duì)照組相比，呈顯著性差異(P<0.05)；第2、3周，兩組大鼠體重又趨于相近，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從第4周開(kāi)始至建模第8周，高脂組大鼠體重均高于同期普通正常對(duì)照組大鼠體重，且差異具有非常顯著性(P<0.01)。

2.2 各組大鼠肝指數(shù)的改變

表3顯示，運(yùn)動(dòng)周期結(jié)束后，F(xiàn)C大鼠組與C組比較，體質(zhì)量平均增加22%(P<0.01)，肝臟質(zhì)量平均增加74%(P<0.01)，肝指數(shù)增加42%(P<0.01)；FE組大鼠與C組相比，體質(zhì)量略有下降，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，肝臟質(zhì)量增加25%(P<0.01)，肝指數(shù)增加30%(P<0.01)；FE組大鼠與FC組相比，體質(zhì)量下降26%(P<0.01)，肝臟質(zhì)量下降28%(P<0.01)，肝指數(shù)下降8%(P<0.01)。

2.3 各組大鼠血清脂代謝指標(biāo)的變化

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，F(xiàn)C組大鼠血清TC明顯高于C組，差異具有非常顯著性(P<0.01)；FE組大鼠TC水平與C組相比，有所升高，差異具有顯著性(P<0.05)，但與FC組相比，有所降低，差異具有顯著性(P<0.05)；TG水平，F(xiàn)C組大鼠明顯高于C組和FE組，差異具有非常顯著性(P<0.01)，F(xiàn)E組與C組相比，略有上升，差異不具有顯著性(P>0.05)；FC組大鼠HDL-c與C組相比，有所下降(P>0.05)；FE組大鼠HDL-c與C組相比降低明顯，差異具有顯著性(P<0.05)；FC組和FE組大鼠LDL-c與C組相比，均有所上升，其中，F(xiàn)C組增加幅度較小(P>0.05)，F(xiàn)E組增高較多，差異具有顯著性(P<0.05)；FC組大鼠FFA水平與C組相比，平均增加了370%(P<0.01)，F(xiàn)E組大鼠與C組相比，F(xiàn)FA水平平均增加211%(P<0.01)，F(xiàn)E組大鼠與FC組相比，F(xiàn)FA水平平均下降43%(P<0.01，表4)。

表 3 各組大鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝指數(shù)變化

n體質(zhì)量(g)肝臟質(zhì)量(g)肝指數(shù)(×10-3)C組7581．75±61．60 12．52±1．57 21．54±1．87 FC組7713．13±44．33☆☆21．87±3．17☆☆30．61±3．43☆☆FE組7562．00±48．89§§15．72±3．55☆☆§§28．02±5．78☆☆§§

注：與C組相比較，☆☆表示P<0.01；與FC組相比較，§§表示P<0.01，下同。

表 4 各組大鼠血清脂代謝各指標(biāo)變化

注：與C組相比較，☆表示P<0.05，☆☆表示P<0.01；與FC組相比較，§表示P<0.05，§§表示P<0.01，。

2.4 肝組織病理學(xué)改變

通過(guò)肉眼觀察，正常對(duì)照組大鼠肝臟組織多呈暗紅色，邊緣銳利，光鏡下如圖1a所示，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝條索排列整齊，肝細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂肪小泡；高脂對(duì)照組肉眼觀察肝組織體積增大，邊緣圓鈍，顏色發(fā)黃，切面有油膩感，光鏡如圖1b所示，鏡下多見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹、氣球樣變,胞質(zhì)內(nèi)脂滴沉積，肝小葉、肝條索不清晰；高脂運(yùn)動(dòng)組肝組織顏色肉眼觀察接近于正常對(duì)照組，光鏡下見(jiàn)圖1c，肝小葉、肝條索狀結(jié)構(gòu)尚清晰，少量脂肪空泡,無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖 1 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化示意圖

2.5 肝組織超微結(jié)構(gòu)的改變

正常對(duì)照組大鼠肝組織電鏡顯示核大而圓，居細(xì)胞一側(cè)，核膜清晰，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器密集豐富，膜結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)良好，線粒體嵴豐富齊整；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，糖原豐富，溶酶體少見(jiàn)(圖2)。高脂對(duì)照組大鼠電鏡下表現(xiàn)為核畸形，核周水腫，線粒體腫脹，嵴部分排列紊亂或消失，細(xì)胞內(nèi)脂滴及空泡樣變數(shù)量明顯增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體有脫落現(xiàn)象(圖3)。高脂運(yùn)動(dòng)組大鼠鏡下可見(jiàn)膜結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較為密集，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂滴及空泡樣變，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)較為明顯，有膠原纖維沉積，與高脂對(duì)照組相比高脂運(yùn)動(dòng)組大鼠核畸形有所減輕，細(xì)胞內(nèi)脂滴及空泡樣變數(shù)量較高脂組明顯減少(圖4)。

圖 2 正常對(duì)照組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)示意圖

圖 3 高脂對(duì)照組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)示意圖

圖 4 高脂運(yùn)動(dòng)組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)示意圖

2.6 各組大鼠肝臟線粒體相關(guān)基因的變化

表5結(jié)果顯示，與C組比較，F(xiàn)C、FE組SREBP1c、SOCS3 mRNA表達(dá)水平增加明顯，具有非常顯著性差異(P<0.05)， FE組與FC組相比，SREBP1c、SOCS3 mRNA表達(dá)水平降低明顯，差異具有非常顯著性(P<0.05)；與C組相比，F(xiàn)C組PPARα mRNA表達(dá)水平有所增加，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)E組組內(nèi)個(gè)體差異較大，與C組相比，PPARα mRNA表達(dá)水平差異不明顯(P>0.05)；與C組相比，F(xiàn)C組和FE組PGC1α mRNA表達(dá)水平有所下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表 5 各組大鼠肝臟線粒體相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化

3 討論與分析

3.1 高脂飲食和運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝臟質(zhì)量和血脂代謝的影響

肝臟是人體內(nèi)最大的代謝器官，在調(diào)節(jié)糖、脂代謝中起著非常重要的作用。NAFLD的發(fā)病機(jī)制至今尚不完全明確，有多種假說(shuō)，其中為多數(shù)學(xué)者接受的是“多平行打擊學(xué)說(shuō)”和“二次打擊學(xué)說(shuō)”。Tilg等提出了“多平行打擊學(xué)說(shuō)”[21]。該學(xué)說(shuō)強(qiáng)調(diào)了一些非常不同的并行過(guò)程導(dǎo)致了肝臟炎癥地發(fā)生——特別是肝外組織如腸和(或)脂肪組織促進(jìn)了肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展，且肝臟炎癥可能先于脂肪肝、肝硬化和肝癌，或者說(shuō)在一定比例上先于它們發(fā)生。Day等第一次將NAFLD和胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)聯(lián)系在一起，提出了“二次打擊學(xué)說(shuō)”[11]。其中，第1次打擊先是甘油三酯累積，脂肪變性，系統(tǒng)性IR的結(jié)果，第2次打擊被認(rèn)為是由于甘油三酯的長(zhǎng)期累積，導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激。這種應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致谷胱甘肽和氧化應(yīng)激之間的不平衡，線粒體功能受損，脂肪酸β氧化功能受損。自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，直接破壞細(xì)胞器或細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在此過(guò)程中，肝臟持續(xù)不斷的慢性損傷將導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌。后續(xù)研究顯示，人體內(nèi)高胰島素血癥(第1次打擊)確實(shí)先于脂肪肝地發(fā)展[20]，同時(shí)第2次打擊更為精細(xì)。除此之外，也出現(xiàn)了很多其他模型，如“四步”理論強(qiáng)調(diào)脂質(zhì)釋放和由于肝靜脈阻塞進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化[26]。該模型解釋疾病形態(tài)學(xué)變化比較有效，相較于其他關(guān)于NAFLD的理論更有助于理解。

在NAFLD患者中多存在糖脂代謝紊亂，體重增加的現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)在造模期間高脂組大鼠體重與正常對(duì)照組大鼠體重均出現(xiàn)了持續(xù)增長(zhǎng)的現(xiàn)像，但增長(zhǎng)幅度略有不同，兩組大鼠體重在造模第1周開(kāi)始出現(xiàn)差異，且差異具有顯著性；在第2、3周體重差異減小，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第4周開(kāi)始體重增長(zhǎng)差別明顯，差異具有非常顯著性，這種狀態(tài)一直持續(xù)到造模的最后一周，第8周。通過(guò)高脂飲食構(gòu)建非酒精性脂肪肝大鼠模型時(shí)，高脂組大鼠體重與正常對(duì)照組相比較會(huì)出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，體重增長(zhǎng)幅度大于正常對(duì)照組，提示，高脂飲食可能更易引起機(jī)體的脂肪蓄積，這與前人的研究結(jié)果一致[1，2]。

飲食誘導(dǎo)的肥胖在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人群中普遍存在，肥胖和超重也是NAFLD獲得認(rèn)可的致病因素。在運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，本研究FC組大鼠中TC、TG和LDL-C水平明顯上升，表明高脂飲食在短期內(nèi)即造成大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，為SD大鼠構(gòu)建非酒精性脂肪肝模型提供可能。同時(shí)，游離脂肪酸出現(xiàn)了非常明顯的升高，差異具有非常顯著性，提示，高脂飲食引起大鼠脂質(zhì)代謝功能障礙，游離脂肪酸不能及時(shí)利用和消除，在體內(nèi)異常蓄積為下一步胰島素抵抗的惡性循環(huán)及加重機(jī)體的氧化應(yīng)激等提供了充分可能。本實(shí)驗(yàn)中游離脂肪酸的顯著增加即與第1次打擊相符，脂質(zhì)代謝障礙使外周脂肪分解速率加快并伴隨有血清游離脂肪酸的增加，不斷增加的FFA被送到肝臟，超過(guò)了肝臟正常負(fù)荷，正常的合成分解動(dòng)態(tài)平衡被破壞，F(xiàn)FA的脂毒性作用于肝臟，使肝臟的氧化利用能力降低，脂質(zhì)在肝臟堆積，進(jìn)而參與脂肪肝地形成。這使得本研究的FC組大鼠肝臟質(zhì)量明顯高于C組，F(xiàn)E組雖有一定程度的改善，但仍高于C組。同時(shí)，F(xiàn)FA的增多也可以作用于第2次打擊，使胰島素抵抗進(jìn)一步惡化，加重肝細(xì)胞的脂肪變性，形成一個(gè)惡性循環(huán)，最終發(fā)展成為脂肪肝。

3.2 高脂飲食和運(yùn)動(dòng)對(duì)肝細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

游離脂肪酸FFA不僅是細(xì)胞代謝的能源物質(zhì)，并且在機(jī)體調(diào)節(jié)糖脂代謝和IR中是一種重要的介質(zhì)，起著非常重要的作用。當(dāng)體內(nèi)FFA含量增多，超出生理負(fù)荷時(shí)，就會(huì)有大量的FFA從脂肪細(xì)胞中溢出，進(jìn)而引起脂毒性作用。其具體表現(xiàn)為大量的FFA涌入肝臟和肌肉組織，以甘油三酯的形態(tài)在肝細(xì)胞內(nèi)異常蓄積。此外，F(xiàn)FA在抑制外周葡萄糖利用的同時(shí)刺激肝臟的糖異生，使血漿FFA增多。肝臟脂肪變性會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化，誘發(fā)產(chǎn)生大量的促氧化物的同時(shí)伴隨抗氧化物的大量減少，從而促使肝細(xì)胞自由基增多，形成一系列的自由基及其代謝產(chǎn)物，如MDA、GSH-PX，4-羥基壬烯酸等，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生交聯(lián)，形成Mallory小體等[5,29]。肝細(xì)胞是體內(nèi)代謝比較旺盛的器官之一，線粒體含量極豐富，且線粒體又是脂肪酸氧化利用的主要細(xì)胞器。FFA的異常增多可以引起線粒體的活性氧自由基ROS即內(nèi)源性自由基增加，啟動(dòng)不飽和脂肪酸氧化，經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)形成脂質(zhì)過(guò)氧化物L(fēng)PO，LPO負(fù)反饋于線粒體并改變其DNA從而抑制電子呼吸鏈的傳遞，如此反復(fù)，最終導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器出現(xiàn)數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)異常的現(xiàn)象。如肝細(xì)胞線粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)腫脹和通透性增加等結(jié)構(gòu)變化，甚至引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而出現(xiàn)肝細(xì)胞脂性凋亡。

本實(shí)驗(yàn)顯示，C組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器含量豐富、核大、居中央，清晰可見(jiàn)大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附著核糖體、線粒體，線粒體排列密集，嵴結(jié)構(gòu)清晰。高脂對(duì)照組大鼠出現(xiàn)了典型的單個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪小泡密集出現(xiàn)，細(xì)胞器3 000倍視野下幾乎不可見(jiàn)，高倍鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量減少，同時(shí)伴隨核糖體減少或消失，線粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)結(jié)構(gòu)腫脹，胞內(nèi)隨處可見(jiàn)增多的溶酶體和脂肪小泡，部分線粒體嵴突大量消失或不見(jiàn)。高脂運(yùn)動(dòng)組大鼠線粒體數(shù)量和結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等結(jié)構(gòu)較高脂對(duì)照組也有明顯的改善，溶酶體和脂肪小泡可見(jiàn)。脂肪變化可以引起體內(nèi)器官產(chǎn)生一些相適應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化，脂肪在肝臟累積形成脂肪肝、脂肪蓄積引起胰腺形態(tài)學(xué)變化可以更好的標(biāo)記胰脂毒性。有研究表明胰腺的脂肪變性通過(guò)內(nèi)鏡超聲可見(jiàn)。有趣的是，引起“脂肪胰腺”的危險(xiǎn)因素與脂肪肝的危險(xiǎn)因素互相重疊[6，8]，提示存在共同的脂毒性作用、脂質(zhì)異位沉積、組織中額外脂肪蓄積最終導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞和器官功能障礙。

3.3 高脂飲食和運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟線粒體相關(guān)基因表達(dá)的影響

有研究[1]發(fā)現(xiàn)，NAFLD與血清瘦素水平關(guān)系密切，是脂肪肝發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這與其他學(xué)者如Tobe等[22]的發(fā)現(xiàn)相同，多元回歸顯示，Leptin是脂肪肝的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而SOCS3的高表達(dá)是瘦素抵抗的標(biāo)志[4,25]，上調(diào)的SOCS3引起肝臟成脂基因SREBP1c的高表達(dá)(圖5)，引起脂質(zhì)在肝臟這一非脂肪組織異常蓄積，進(jìn)而引起肝細(xì)胞、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常。

圖 5 非酒精性脂肪肝大鼠肝組織脂肪變性的可能機(jī)制示意圖

SREBPs是一類(lèi)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白，SREBP1c是參與脂肪合成基因的主要調(diào)節(jié)因子，對(duì)正常非脂肪組織脂肪含量的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，此過(guò)程受Leptin的抑制[3]，SREBP1c主要與脂肪酸代謝和糖代謝有關(guān)。若出現(xiàn)瘦素抵抗等瘦素作用缺乏的情況，而胰島素含量增多或作用增加，SREBP1c將會(huì)出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，脂肪合成相關(guān)的酶水平或活性增加，TG含量增多，造成脂肪在非脂肪組織(如肝臟)的異常蓄積，形成脂肪肝。在肝臟、脂肪組織中SREBP1c/ SREBP1a的比值是9.3，可見(jiàn)，SREBP1c是肝組織固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的主要亞型[3]。SREBP1c是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與幾乎所有的肝臟TG和脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明[16]，在發(fā)生NAFLD時(shí)，SREBP1c表達(dá)增強(qiáng)，幾乎是對(duì)照組的5倍，而SREBP1c轉(zhuǎn)基因鼠則可自然發(fā)生NAFLD。Kakuma等[15]實(shí)驗(yàn)證明，fa/fa肥胖大鼠肝臟、胰腺的SREBP1c表達(dá)增加，而用基因沉默技術(shù)造成瘦素抵抗的同種大鼠肝臟SREBP1c基因表達(dá)顯著降低。在本實(shí)驗(yàn)中，高脂對(duì)照組大鼠與正常對(duì)照組相比，SREBP1c基因表達(dá)量增加8.68倍，與本研究結(jié)果類(lèi)似的研究有Tobe等[23]對(duì)IRS2-/-的IR小鼠研究，發(fā)現(xiàn)肝臟SREBP1c基因轉(zhuǎn)錄明顯增加。這一情況在實(shí)驗(yàn)初期血糖水平正常的病程早期也不例外，表明，SREBP1c基因表達(dá)增加既不是由高血糖引起，也不是由高胰島素引起。Tobe等[23]的研究中用高瘦素處理小鼠后，小鼠出現(xiàn)了攝食減少和體重減輕，同時(shí)SREBP1c基因的過(guò)度表達(dá)也得到了較好的控制，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究相似。在本實(shí)驗(yàn)的NAFLD大鼠模型中存在一定程度的瘦素抵抗，且由于瘦素抵抗抑制了SREBP1c在肝臟的正常脂質(zhì)代謝功能，進(jìn)一步引起肝臟這一非脂肪組織脂肪累積，形成一個(gè)惡性循環(huán)。FE組大鼠的SREBP1c基因表達(dá)出現(xiàn)了明顯的降低，提示可能是通過(guò)運(yùn)動(dòng)刺激使得大鼠恢復(fù)對(duì)瘦素的敏感性，進(jìn)而恢復(fù)瘦素對(duì)SREBP1c的負(fù)調(diào)控。

SOCS3升高是瘦素抵抗的標(biāo)志[4]，Lagathu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，增多的FFA可通過(guò)使SOCS3高表達(dá)加重IR。Ueki等[24]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SOCS3參與NAFLD的發(fā)生，不僅是由于SOCS3作用于胰島素信號(hào)通路，從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，SOCS3還可上調(diào)SREBP1c的表達(dá)，使肝臟這一非脂肪組織的脂肪蓄積異常。在本實(shí)驗(yàn)(圖5)和此前的研究中發(fā)現(xiàn)[1]，瘦素抵抗可能是NAFLD獨(dú)立的發(fā)病危險(xiǎn)因素，這一點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)中依然存在，SOCS3的高表達(dá)標(biāo)志著瘦素抵抗的存在，F(xiàn)C組SOCS3 mRNA基因的表達(dá)是C組的6倍多，F(xiàn)C組存在明顯的瘦素水平升高。這說(shuō)明，NAFLD進(jìn)程中存在的高瘦素水平，且SOCS3水平的增加也從另一面證實(shí)了其中存在的瘦素抵抗。SOCS3的高表達(dá)可以使STAT下調(diào)，同時(shí)STAT是抑制SREBP1c啟動(dòng)活性的分子，SOCS3水平的升高促使SREBP1c mRNA表達(dá)量增加，從而啟動(dòng)一系列脂肪酶的活性，從而使脂肪酸合成增多。而FE組大鼠通過(guò)運(yùn)動(dòng)刺激明顯減輕了瘦素抵抗現(xiàn)象，使得肝臟超微結(jié)構(gòu)中線粒體的數(shù)量和功能有了較明顯地恢復(fù)。

過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族中配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，有3種亞型，與脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝、脂蛋白代謝、細(xì)胞增殖等關(guān)系密切。PPARα主要在肝臟中表達(dá)，參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化的幾種關(guān)鍵酶的表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)線粒體和過(guò)氧化物酶體氧化水平及相關(guān)基因表達(dá)來(lái)刺激脂肪代謝，保護(hù)肝臟，避免肝細(xì)胞脂肪變性。PGC1α屬于轉(zhuǎn)錄輔助活化因子家族，也是脂肪細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，PGC1α在肝臟中的主要作用是促進(jìn)肝糖異生、調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪代謝。PPARα與PGC1α的共同作用是PGC1α調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪酸氧化的重要途徑。在饑餓、寒冷或禁食狀態(tài)下，PGC1α能激活肝臟脂肪酸氧化中PPARα目標(biāo)基因的表達(dá)，PGC1α基因沉默小鼠肝臟脂肪酸氧化率降低，引起肝細(xì)胞脂肪變性，PGC1α-/-小鼠參與氧化的PPARα基因沒(méi)有下調(diào)，而肝細(xì)胞線粒體功能下降。這提示，可能是由于線粒體功能下調(diào)而引起PGC1α-/-小鼠出現(xiàn)脂肪酸氧化率降低。PGC1α可與SREBP競(jìng)爭(zhēng)HNF4α結(jié)合位點(diǎn)，干擾PGC1α的募集，從而抑制糖異生[28]。PGC1α是PPAR的輔助激活因子，協(xié)同PPARα作用于肝臟的脂質(zhì)代謝、與脂質(zhì)運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，在生理狀態(tài)下保護(hù)肝臟，防止肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性。本實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)C組大鼠均出現(xiàn)了PPARα mRNA基因表達(dá)的上升，可能是由于肝臟中肝細(xì)胞的脂肪變性引起了PPARα mRNA基因表達(dá)的升高，以求肝臟能夠盡可能的將多余的脂肪酸氧化利用，同時(shí)伴隨出現(xiàn)了PGC1α mRNA基因表達(dá)水平的下調(diào)。由前面的肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察可得出肝細(xì)胞脂肪變性，引起了肝細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，線粒體數(shù)目和活性均受到影響，進(jìn)而引起PGC1αmRNA基因表達(dá)的下調(diào)。由于PGC1α mRNA基因表達(dá)的下調(diào)在一定程度上也影響了PPARα的表達(dá)，引起肝細(xì)胞脂肪酸氧化障礙，加重NAFLD中存在的肝細(xì)胞脂肪變性。而運(yùn)動(dòng)在很大程度上使PGC1α得以恢復(fù)，PGC1α協(xié)同PPARα作用于肝臟，促進(jìn)肝糖異生、肝細(xì)胞脂肪代謝，使肝細(xì)胞線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能趨于正常。

4 結(jié)論

1.16周高脂飲食NAFLD大鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的肝臟脂質(zhì)異常蓄積，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)畸形。

2.規(guī)律的、強(qiáng)度適宜的有氧運(yùn)動(dòng)可明顯改善NAFLD大鼠中存在的脂質(zhì)代謝紊亂，可能通過(guò)促進(jìn)肝臟細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能趨于正常，從而減少肝臟這一非脂肪組織的脂肪蓄積，減輕肝臟脂肪變性程度，促進(jìn)非酒精性脂肪肝的良性轉(zhuǎn)歸。

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Impact of Aerobic Exercise on the Function and Mitochondrial Structure of Liver Cell in NAFLD Rats

LIU Qian-qian1,QIN Zhi2,HOU Gai-xia1,XI Xue-feng1,XIAO Guo-qiang3

Objective:To observe the effects of eight weeks of swim-training on the abnormal accumulation of liver lipid,disorders of function and mitochondrial structure in NAFLD rats.Methods:Dividing 35 rats (3 month old) SPF male SD rats into normal control group (C group,9 rats,fed with standard diet) and high fat diet group (26 rats at random,fed with high fat diet to build the NAFLD model).Dividing the high fat diet group into high fat control group (FC,13 rats) and high fat exercise-training group (FE,13 rats) at random.The exercise training groups had an 8 weeks swimming training (6 days in one week).After the training,measuring liver index and serum lipid levels,using microscope to measure liver steatosis,observing the structure and number changes of liver cell mitochondria by electron microscope.Detecting the mRNA levels of SOCS3,SREBP1c,PPARα,PGC-1α by ORT-PCR.Results:Compared with the C group,body weight,liver weight,liver fat,TC,FFA,SREBP1c,the expressions of SOCS3 mRNA in FC group significantly increased (P<0.01 orP<0.05),HDL-c reduced (P<0.05);compared with the FC group,body weight,liver weight,liver index,TC,FFA,SREBP1c,and the expressions of SOCS3 mRNA in FE group significantly decreased (P<0.01 orP<0.05).The microscopic structure showed that in C group,hepatic lobular had clear structure,the hepatic cord arranged orderly,the liver cells had no fat vacuoles,mitochondrial cristae was rich and well-organized;in FC group,hepatic lobule structure disappeared,with nucleus abnormal,perinuclear edema,and mitochondria swelling,cristae was disappear or arranged chaos,the number of intracellular lipid droplets and changed vacuolar significantly increased;in FE group,hepatic lobular and hepatic cord had clear structure,membrane structure was normal,mitochondria and endoplasmic reticulum were relatively dense,intracellular lipid droplets and vacuolar degeneration appeared,mitochondrial cristae structure was relatively obvious.Conclusion:1) after 16 weeks’ high fat diet,the NAFLD rats’ liver had obviously abnormal accumulation of liver lipid,with disorder of liver structure,the number of mitochondria in liver cells decreased,with mitochondria’s structural abnormalities;2) Regular and appropriate intensity aerobic exercise can significantly improve lipid metabolic disorder in NAFLD rats,which probably promoting mitochondria number,morphology,structure and function of liver cell to be normal,then reducing fat accumulation in the liver,relieving liver fatty degeneration,and promoting the benign outcome of non alcoholic fatty liver.Key words：NAFLD;fat-freemass;livercell;mitochondrialstructure;adiposedegeneration;rat

1002-9826(2016)05-0075-08

10.16470/j.csst.201605011

2015-04-28；

2016-07-05

河南省教育廳人文社會(huì)科學(xué)研究項(xiàng)目(2016-QN-178)。

劉倩倩(1986-)，女，山東聊城人，講師，博士，主要研究方向?yàn)槁圆〉倪\(yùn)動(dòng)防治、運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的生物學(xué)適應(yīng)， E-mail：wwwstrom@sina.com。

1.河南大學(xué) 體育學(xué)院，河南 開(kāi)封 475001；2.武漢體育學(xué)院，湖北 武漢 430079；3.華南師范大學(xué)，廣東 廣州 510006 1.Henan University,Kaifeng 475001,China.2.Wuhan Sports University,Wuhan 430079,China.3.South China Normal University,Guangzhou 510006,China.

G804.2

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