有氧運動對心肌細胞增殖的影響及CBP的調(diào)控作用

胡玉龍，徐 慧,2，劉艷秋，李寧川，陳志軍，昝 銷

有氧運動對心肌細胞增殖的影響及CBP的調(diào)控作用

胡玉龍1，徐 慧1,2，劉艷秋3，李寧川1，陳志軍1，昝 銷1

目的：探討有氧運動對心肌細胞增殖的激活和cAMP反應元件結(jié)合蛋白綁定蛋白(CBP)在其中的調(diào)控作用。方法：采用游泳訓練(Swim)2周構(gòu)建運動性心肌肥大模型，采用主動脈弓縮窄術(TAC)2周構(gòu)建病理性心肌肥大模型。12周齡雄性C57Bl/6J小鼠隨機分為4組：對照組(Control)、運動性心肌肥大組(Swim)、假手術組(Sham)、病理性心肌肥大組(TAC)，每組10只。實驗結(jié)束后，采用二維超聲心動圖檢測室間隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPW)和心功能。對心肌組織蛋白采用Western Blot檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的表達水平，衡量心肌細胞增殖能力。采用RT-PCR、Western Blot和免疫組化的方法檢測心肌細胞中CBP的表達水平。為驗證CBP對心肌細胞增殖能力的激活作用，在離體實驗中，以去氧腎上腺素(PE)誘導原代心肌細胞產(chǎn)生肥大，采用CBP抑制劑C646抑制CBP表達。離體實驗分組情況：1)對照組(Control)；2)PE組；3)C646組；4)PE+C646組。對心肌細胞爬片進行α-肌動蛋白(α-actin)的免疫熒光實驗檢測心肌細胞大小，免疫熒光檢測增殖細胞核抗原Ki67的表達衡量心肌細胞增殖水平，RT-PCR檢測CBP的mRNA水平。結(jié)果：1)游泳運動和TAC均能使小鼠產(chǎn)生明顯的心肌肥大，與相應的對照組相比，兩種心肌肥大模型的IVS、LVPW、左室容量(LV Vol)和射血分數(shù)(EF)都有明顯升高(P<0.05)。2)Swim組小鼠心肌組織PCNA蛋白表達水平明顯高于Control組(P<0.05)和TAC組(P<0.01)。3)Swim組心肌組織CBP的mRNA水平比Control組明顯升高(P<0.01)，且明顯高于TAC組(P<0.05)。Swim組心肌組織CBP蛋白表達水平與Control組相比有明顯升高(P<0.05)，且顯著高于TAC組(P<0.01)，TAC組比Sham組明顯降低(P<0.05)。心肌組織切片CBP的免疫組化結(jié)果顯示，Swim組CBP陽性細胞顯著多于Control組(P<0.01)與TAC組(P<0.01)。4)離體實驗結(jié)果顯示，PE組心肌細胞面積顯著高于Control組(P<0.05)和PE+C646組(P<0.05)。PE能使CBP的mRNA表達水平比Control組明顯升高(P<0.01)，PE+C646組CBP的mRNA水平比PE組明顯降低(P<0.01)。PE組Ki67陽性細胞與Control組相比明顯增多(P<0.01)，PE+C646組Ki67陽性細胞與PE組相比明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：有氧運動能明顯激活心肌細胞的增殖能力，并伴隨著CBP的mRNA和蛋白表達水平升高，抑制CBP的表達水平可以抑制心肌細胞的增殖能力，提示，CBP在有氧運動促進心肌細胞增殖的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

有氧運動；心肌肥大；心肌細胞增殖；CBP

心肌肥大是導致心血管疾病發(fā)生率和死亡率增高的獨立危險因子，是心力衰竭的前驅(qū)病變。運動性心肌肥大是運動訓練中的普遍生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為心肌細胞、血管、間質(zhì)成比例地增生，側(cè)枝循環(huán)大量建立，有效地緩解了心肌肥大可能引發(fā)的相對缺血，維護了心臟的泵血功能[6,19]。因此，心肌細胞的增殖能力是決定心肌肥大發(fā)展轉(zhuǎn)歸和預后的重要因素，尋找心肌細胞增殖的調(diào)控因素，對于減少心力衰竭和心臟破裂猝死的風險，保障人們生命健康具有十分重要的意義。

運動對心肌細胞增殖的影響一直受到人們的關注。運動訓練可以導致心肌肥大和心臟收縮能力加強，泵血功能增加。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，大鼠心梗手術后5周進行游泳或跑臺運動，可減輕左心室擴張，非梗死區(qū)室壁發(fā)生適應性肥大，梗死面積縮小。運動還可誘導高血壓大鼠心肌大量祖細胞趨向分化[13]?？梢?，運動對成體心肌細胞的再生、增殖具有促進作用，但其具體的機制和信號通路，目前還不是很清楚。因此，探討運動對心肌細胞增殖的促進作用和關鍵調(diào)控分子，可為臨床缺血性心肌疾病的治療和康復運動提供理論依據(jù)和策略方法。

cAMP反應元件結(jié)合蛋白(cyclic-AMP-responsive element binding protein,CREB)是核內(nèi)刺激基因轉(zhuǎn)錄的增強因子，CREB只有和CREB綁定蛋白(CREB-bingding protein,CBP)結(jié)合成復合物后，才能實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能，因此CBP又被稱為CREB的輔助激活因子[17]。目前發(fā)現(xiàn)，CBP能與多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，與胚胎發(fā)育、細胞生長和維持穩(wěn)態(tài)等活動密切相關[14,15,20]。本研究主要觀察運動性和病理性心肌肥大在心肌細胞增殖方面的表型差異，并探討了CBP在心肌細胞增殖中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性C57Bl/6J小鼠，12周齡，購于揚州大學動物比較中心(動物許可證號：SYXK蘇2012-0029)。實驗小鼠隨機分為4組：對照組(Control)，運動性心肌肥大組(Swim)，假手術組(Sham)，病理性心肌肥大組(TAC)，每組10只。飼養(yǎng)溫度25℃±2℃，自然采光，分組分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只。

1.2 運動方案

運動性心肌肥大組進行游泳耐力訓練，游泳池體積為60 cm×40 cm×60 cm，水深為40 cm，水溫為31℃～34℃。正式訓練前9天為適應階段，從第1天的10 min逐漸增加到第9天的90 min。正式訓練時每天上、下午各1次，每次持續(xù)訓練90 min，維持此強度訓練2周。對照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3 病理性心肌肥大模型構(gòu)建

病理性心肌肥大組小鼠進行主動脈弓縮窄手術(transverse aortic constriction,TAC)構(gòu)建。TAC手術操作要點如下[2，11]：采用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)氣管插管與嚙齒動物呼吸機連接。經(jīng)頸部正中切口向下暴露主動脈弓部，在左頸總動脈與頭臂干之間血管下方穿一個7-0號絲線，并緊貼血管放置一個26號針頭，用絲線將動脈與針頭一起扎緊并迅速抽出針頭，按照統(tǒng)一標準造成不完全縮窄，術后飼養(yǎng)2周。假手術組小鼠行開胸手術暴露主動脈弓但不進行動脈縮窄，進行縫合術后飼養(yǎng)2周。

1.4 實驗儀器和試劑

主要儀器有小動物高頻彩色超聲系統(tǒng)(General Electric Co.,Fairfield,Conn)，動物呼吸機(ALC-V8)，冷凍切片機(LEICA)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS,IX51)，低溫高速離心機(Eppendrof)，實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500)，電泳儀和轉(zhuǎn)移槽(BioRad)，凝膠掃描成像系統(tǒng)(UVP,GDS-8000)等。主要試劑包括：抗CBP、PCNA、Lamin A、GAPDH一抗，購自Santa Cruz公司和康成生物；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master (ROX)試劑盒，購自Invitrogen公司；PE、C646購自Sigma公司。

1.5 二維超聲心動圖檢測

小鼠腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉后，脫毛固定四肢于操作臺上。取左室長軸切面二尖瓣水平，在第4肋間探及，探頭頻率為13 MHz，掃描速度100 mm/s，在二維超聲引導下取M超聲曲線。觀測指標：心臟室間隔厚度(interventricular septum dimension,IVS)、左室后壁厚度(LV posterior wall dimension,LVPW)、左室射血分數(shù)(ejection fractional shortening,EF)和左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)等心功能指標。

1.6 實時熒光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)

充分研磨心肌組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR操作按試劑盒說明書進行，引物由Invitrogen公司合成，序列見表1。反應體系為SYBR Green (ROX) 10 μl，上、下游引物共0.6 μl，cDNA 100 ng，DEPC水加至總體積20 μl，充分混勻。PCR反應條件為：50℃預處理2 min，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s共反應40個循環(huán)。ABI 7500軟件記錄數(shù)據(jù)并分析，將目的基因的Ct值與內(nèi)參GAPDH的Ct值進行標準化，計算出目的基因的相對表達量。

表 1 本研究目的基因引物序列

1.7 Western Blot實驗

采用蛋白提取液分別抽提胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。等量蛋白采用8% SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫搖動封閉(5%脫脂牛奶)1 h。分別加入鼠抗CBP(1∶200)，兔抗PCNA(1∶200)，兔抗Lamin(1∶200)，鼠抗GAPDH(1∶1 000)多克隆抗體。4 ℃孵育過夜，室溫下洗膜后加入相應二抗孵育1 h，用化學發(fā)光底物ECL(Promega)進行發(fā)光顯影。

1.8 乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)

取2～4天的SD乳鼠心臟，置于DMEM培養(yǎng)基中，充分剪碎，加入0.08% 胰酶2 ml，37℃水浴震蕩，多次消化收集上清，至無明顯顆粒。所有上清經(jīng)1 000 rpm，離心10 min。棄上清，沉淀用300 μl DEME重懸，反復吹打，即為細胞懸液。經(jīng)篩網(wǎng)過濾后，計數(shù)并分別接種于6孔板和24孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長后，分為4組：1)Control組，不做任何處理，細胞正常培養(yǎng)；2)PE組，給予去氧腎上腺素(Phenylephrine,PE)誘導心肌細胞肥大和增殖(10 μM)，處理24 h；3)C646組，加入CBP抑制劑C646(30 μM)抑制CBP的表達，處理30 min后換正常培養(yǎng)基；4)PE+C646組，細胞貼壁生長后，加入C646處理30 min后，換正常培養(yǎng)液，加PE處理24 h。收取4組心肌細胞，進行心肌細胞免疫熒光及提取心肌細胞總RNA。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 在體實驗結(jié)果

2.1.1 兩種心肌肥大模型心室壁厚度和心功能結(jié)果比較

二維超聲心動圖詳細數(shù)據(jù)見表2，心超結(jié)果提示，兩種造模方法都能使小鼠心肌產(chǎn)生肥厚。Swim組和TAC組小鼠收縮期和舒張期IVS和LVPW與相應的對照組相比都有明顯增加(P<0.05)。Swim組LVIDs，收縮期、舒張期LV Vol比Control組明顯減小(P<0.05)，TAC組收縮期、舒張期LVID、LV Vol與Sham組相比都有明顯減小(P<0.05)。Swim組和TAC組EF和FS與相應的對照組相比，都有明顯升高(P<0.05)。提示，兩種心肌肥大模型尚處于向心性肥大階段，因此心室內(nèi)徑減小，心功能尚處于代償期，甚至有所升高。

表 2 二維超聲心動圖檢查的各項數(shù)據(jù)

注：a表示與Control組比較，P<0.05；b表示與Sham組比較，P<0.05，n=10。IVSd：舒張期室間隔厚度；IVSs：收縮期室間隔厚度；LVPWd：舒張期左室后壁厚度；LVPWs：收縮期左室后壁厚度；LVIDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVIDs：左室收縮末期內(nèi)徑； LV Vol d：左室舒張末期容積；LV Vol s：左室收縮末期容積；EF：射血分數(shù)；FS：縮短分數(shù)。

2.1.2 兩種心肌肥大模型心肌細胞增殖程度比較

增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear autigen,PCNA)存在于細胞核內(nèi)，是DNA合成和復制所必須的輔助因子，也是細胞增殖的分子標志。采用Western blot方法檢測各組小鼠心肌組織PCNA的蛋白表達水平。如圖1所示，Swim組和TAC組小鼠心肌組織PCNA表達水平分別較Control組(P<0.01)和Sham組(P<0.05)顯著增高，其中Swim組升高更為明顯，與TAC組比較也有顯著性差異(P<0.05)。提示，Swim和TAC均可以使小鼠心肌細胞發(fā)生一定程度的增殖，但有氧運動對心肌細胞地增殖具有更為明顯的激活作用。

圖 1 各組小鼠心肌組織PCNA表達水平示意圖

2.1.3 兩種心肌肥大模型心肌組織CBP的表達差異

對心肌組織冰凍切片進行CBP的免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)(圖2A、2B)，與Control組相比，Swim組小鼠心肌CBP陽性細胞顯著增多(P<0.01)，TAC組的CBP陽性細胞與相應對照組相比沒有明顯改變。Swim組心肌組織CBP陽性細胞比TAC組顯著增多(P<0.01)。

對各組小鼠心肌組織總RNA進行RT-PCR檢測CBP的表達水平(圖2C)，結(jié)果可見，與Control組相比，Swim組小鼠心肌組織CBP的mRNA水平顯著升高(P<0.01)；而TAC組與Sham組相比，CBP的mRNA水平有輕微增加，但無統(tǒng)計學差別。Swim組和TAC組相比，CBP的mRNA水平有顯著性差異(P<0.05)。

采用Western blot檢測各組小鼠心肌組織胞核的CBP蛋白表達水平。如圖2D和2E所示，Swim組與Control組相比，小鼠心肌組織中CBP表達水平顯著增高(P<0.05)；TAC組較Sham組，CBP表達水平顯著下降(P<0.05)。而Swim組與TAC組相比，CBP表達水平存在顯著性差異(P<0.01)。

2.2 離體實驗結(jié)果

2.2.1 各組心肌細胞肥大程度比較

離體實驗采用給予PE誘導原代心肌細胞產(chǎn)生肥大，以CBP的抑制劑C646抑制CBP的表達。PE能在體外誘導心肌細胞產(chǎn)生肥大和增殖[10,16]，C646是新發(fā)現(xiàn)的抑制CBP的小分子化學抑制劑，能減少CBP表達，抑制其乙?；傅幕钚訹8]。對心肌細胞進行熒光抗體標記肌動蛋白(α-actin)，檢測心肌細胞面積，以此衡量心肌細胞肥大程度。如圖3A、3B所示，PE能誘導心肌細胞肥大，PE處理組與Control組相比，心肌細胞面積增大明顯(P<0.05)。而C646能明顯抑制PE誘導的心肌細胞肥大，PE+C646組與PE組比較，心肌細胞面積明顯減小(P<0.05)；只使用C646的C646組小鼠，其心肌細胞面積與PE比較也有顯著減小(P<0.01)。

圖 2 各組小鼠心肌組織CBP的表達水平示意圖

圖 3 離體實驗各組心肌細胞肥大程度示意圖

2.2.2 各組心肌細胞CBP的mRNA表達水平比較

由圖4可見，與Control組相比，PE組心肌細胞CBP的mRNA水平顯著升高(P<0.01)；C646組較Control組有輕微上調(diào)，但兩組間無統(tǒng)計學差異?？梢?C646處理能顯著降低PE引起的CBP的mRNA水平上升(P<0.01)，這與各組心肌細胞肥大的趨勢相吻合。

圖 4 離體實驗各組心肌細胞CBP的mRNA表達水平示意圖

2.2.3 各組心肌細胞增殖程度比較

Ki67是一種與增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，Ki67的表達水平可作為衡量細胞增殖的標志性指標。如圖5A、5B所示，PE組與Control組相比，Ki67表達陽性的心肌細胞顯著增多(P<0.01)；PE+C646組，Ki67陽性心肌細胞與PE組相比顯著減少(P<0.05)。提示，CBP的表達水平受到抑制，能下調(diào)心肌細胞的肥大和增殖。

3 分析與討論

3.1 運動性和病理性心肌肥大在表型方面的差異分析

心肌肥大是心臟對外界刺激的一種結(jié)構(gòu)代償性反應，分為運動性和病理性兩種。二者在發(fā)病機制、疾病轉(zhuǎn)歸、預后等方面都存在諸多差異。在心肌肥大的發(fā)病機制中，心肌細胞的增殖尤為重要。心肌細胞增殖可以改善心肌的舒縮功能，有效防止心腔擴大和心力衰竭。本研究以游泳運動構(gòu)建運動性心肌肥大模型，用TAC法構(gòu)建病理性心肌肥大模型，探討運動性和病理性心肌肥大在心肌細胞增殖上的差別及調(diào)控因子。

圖 5 離體實驗各組心肌細胞增殖程度示意圖

研究表明，游泳運動和TAC法都能使小鼠左室室壁和室間隔增厚，提示，兩種方法都能誘導小鼠心肌產(chǎn)生肥大，其中病理性心肌肥大模型更為明顯，而LVIDd和LVIDs下降，提示，兩種心肌肥大模型都處于早期，心室肌增厚明顯，出現(xiàn)向心性肥大，心室內(nèi)徑略有下降，射血分數(shù)略有升高，心功能都處于代償期。病理性心肌肥大早期，因為心室壁肥厚明顯，心室內(nèi)徑減小，左心室舒張末期容積顯著減少，每搏輸出量減少，但EF值不降反升。而到了病理性心肌肥大后期，由于大量心肌細胞凋亡壞死，心室腔擴大，心肌舒縮乏力，EF值才會出現(xiàn)明顯降低。所以，在評定心臟泵血功能時，不能單純考慮每搏輸出量和射血分數(shù)，心臟的舒張功能也很重要。有研究表明，病理性心肌肥大中心臟功能變化主要表現(xiàn)為舒張功能降低[4]。進而使心室充盈不足，從而嚴重影響心臟的泵血功能。

在研究中也發(fā)現(xiàn)[2]，運動性心肌肥大模型心肌組織只有少量膠原纖維沉積，而病理性心肌肥大模型膠原纖維大量沉積，且大都堆積于血管周圍。游泳運動使心肌中胚胎型基因心鈉肽(attrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的mRNA表達水平僅有輕微增加，而病理性心肌肥大小鼠心肌中ANP、BNP的mRNA表達水平顯著增加。

綜上，游泳運動訓練和主動脈弓縮窄術都能誘導小鼠心臟出現(xiàn)明顯的肥大，且二者的肥大程度沒有明顯差異。有氧訓練誘導的心肌肥大沒有明顯的缺氧和損傷情況，但病理性心肌肥大具有較為嚴重的間質(zhì)纖維化改變和心肌組織缺氧。

3.2 運動性和病理性心肌肥大在心肌細胞增殖方面的差異分析

一直以來，成體心肌細胞被認為是終末分化細胞，不再有增殖能力，細胞數(shù)目不會增加。但正常生理和運動狀態(tài)下心肌細胞也有死亡和凋亡，心肌細胞數(shù)量卻沒有減少，提示，心肌細胞有一定的增殖能力，使心肌細胞數(shù)量處于動態(tài)平衡。隨著研究技術的進步，科學家們逐漸發(fā)現(xiàn)，心肌組織中仍有部分心肌細胞處于有絲分裂期，缺血性心肌病患者處于有絲分裂期的細胞數(shù)量會大為增加[3,7]。Waring等[18]的研究結(jié)果表明，有氧運動組大鼠的肥大心肌細胞(體積>40 cm3)數(shù)量多于安靜對照組，且運動組新生心肌細胞(體積<10 cm3)的細胞數(shù)量也多于安靜對照組，說明，有氧運動不僅促進了大鼠心肌細胞肥大，且誘導了心肌細胞地增殖。本研究結(jié)果顯示，游泳運動組小鼠心肌組織PCNA蛋白表達顯著增高，說明有氧運動使心肌細胞的增殖明顯激活。雖然運動性和病理性心肌肥大模型心肌PCNA的蛋白表達均有所升高，但上升幅度存在明顯差異。其可能的原因是病理性心肌肥大模型的心肌細胞缺血、缺氧，能量代謝紊亂，心肌細胞增殖功能被部分激活，但不是很明顯；而有氧運動對心肌細胞的增殖功能激活明顯，抑制間質(zhì)增生，減緩心室重構(gòu)過程，使心臟舒縮功能增強，維持了心臟泵血功能。

3.3 CBP在有氧運動促進心肌細胞增殖能力中的作用

CREB是心肌細胞增殖通路IGF-1/Akt下游一個核內(nèi)刺激基因轉(zhuǎn)錄的增強因子，其結(jié)合蛋白CBP最早作為一種與CREB結(jié)合的核蛋白被分離出來，CBP的KIX域與磷酸化的CREB的KID域相互作用形成復合物后，CREB才能實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，CBP能與多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，對骨骼、血細胞、肝細胞、骨骼肌等地增殖、再生過程發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[9，14,17]。曾維政等[5]研究認為，CBP是將轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號轉(zhuǎn)化為生物學效應的關鍵分子，TGF-β可以調(diào)節(jié)細胞生長和分化，促進膠原蛋白合成。肝組織中的CBP可以引起膠原蛋白合成、肝細胞增生、肝小葉重建。

CBP對心肌細胞的影響也有報道。Gusterson等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PE誘導新生乳鼠心肌細胞產(chǎn)生肥大的過程中， CBP和p300這一對轉(zhuǎn)錄的共激活物被激活。構(gòu)建反義引物或顯性負性突變可以明顯抑制PE誘導的心肌肥大。心肌細胞表現(xiàn)為蛋白合成減少，DNA率和細胞大小均減小。過表達CBP或p300時則可以導致心肌細胞肥大。因此，在PE誘導的心肌肥大中，CBP和p300承擔著至關重要的作用，這種作用是通過組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)介導的。陳國珍等[1]研究表明，CBP在胚胎小鼠心臟發(fā)育階段高表達，在心臟的發(fā)生發(fā)育中發(fā)揮重要作用。但CBP對心肌細胞增殖的影響，目前仍沒有定論。

本研究結(jié)果提示，運動性心肌肥大小鼠心肌中CBP 的mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào)，且心肌細胞的增殖功能被明顯激活。而在病理性心肌肥大中CBP的蛋白表達水平明顯下調(diào)，心肌細胞增殖也不明顯，提示，CBP的表達水平與心肌細胞細胞增殖之間存在某種關聯(lián)。

為進一步探討CBP的表達水平與心肌細胞增殖能力之間的關系，本研究利用體外實驗進行了驗證。對原代乳鼠心肌細胞采用PE誘導細胞肥大和增殖激活，發(fā)現(xiàn)其CBP的mRNA水平顯著升高，細胞增殖功能也明顯激活。而給予CBP的抑制劑C646處理后，心肌細胞CBP的mRNA水平明顯受到抑制，心肌細胞面積減小，增殖能力也受到明顯抑制，說明，CBP的表達水平對心肌肥大和心肌細胞增殖確實起到了關鍵性作用。

4 結(jié)論

運動性心肌肥大發(fā)生過程中，有氧運動能促使CBP表達水平升高，進而促進心肌細胞增殖、肥大，使心肌組織收縮能力加強，心功能明顯改善。抑制CBP的表達水平后，可以抑制心肌細胞的增殖和肥大。對于缺血性心肌疾病的病人，建議適當?shù)挠醒踹\動或采用內(nèi)源性激活CBP的方法，使心肌細胞的增殖功能激活，起到減緩心室重構(gòu)，保護心功能的作用，這將成為新的治療思路和靶點。

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Effect of Aerobic Exercise on Cardiomyocyte Proliferation and Regulation of CBP

HU Yu-long1,XU Hui1,2,LIU Yan-qiu3,LI Ning-chuan1,CHEN Zhi-jun1,ZAN Xiao1

Objective:To explore the effect of aerobic exercise on the activation of cardiomyocyte proliferation in cardiac hypertrophy and the role of cyclic-AMP-responsive element binding protein binding protein (CBP) in it by in vivo and in vitro experiments.Method:The exercise-induced cardiac hypertrophy model was made by swim training for 2 wks,and the pathological model was made by transverse aortic constriction (TAC) for 2 wks.12-week-old C57Bl/6J mice were divided randomly into control group,swim group,sham group and transverse aortic constriction (TAC) group.By the end of experiments,cardiac hypertrophy,contractility were evaluated by echocardiography.The expression level of myocardial proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were examined by Western Blot to evaluate the degree of cardiomyocytes proliferation.The expression level of myocardial CBP were examined by RT-PCR,Western Blot and immunohistochemical methods.To verify the effect of CBP on activation of cardiomyocytes proliferation,we did in vitro experiment on primary cardiomyocytes.In this experiment,cardiomyocyte hypertrophy was induced by phenylephrine (PE),and C646 was used to inhibit the expression of CBP.The primary cardiomyocytes were divided randomly into 4 groups in vitro,control,PE,C646 and PE+C646 groups.Meanwhile,cardiomyocyte hypertrophy was detected by α-actin immunofluorescence,CBP mRNA expression was detected by RT-PCR,and the expression level of Ki67 was detected by immunofluorescence to evaluate the degree of cardiomyocytes proliferation.Results:1) Compared with corresponding control groups,inter ventricular septum thickness (IVS),left ventricular posterior wall thickness (LVPW),left ventricle volume (LV Vol) and ejection factor (EF) of exercise-induced and pathological cardiac hypertrophy models were significantly increased (P<0.05).2) The protein expression level of PCNA in swim group was higher than that of control group (P<0.05) and TAC group (P<0.01).3) CBP mRNA expression of swim group was increased significantly than that of control (P<0.01) and TAC group (P<0.05).CBP protein expression of TAC was decreased significantly than that of Sham (P<0.05),and the level of swim were higher obviously than those of control (P<0.05) and TAC (P<0.01).The immunohistochemistry of CBP showed that CBP-positive cells of Swim was significantly more than Control (P<0.01) and TAC group (P<0.01).4) The results of in vitro experiment were that primary cardiomyocytes performance hypertrophy induced by PE (P<0.05),and use of C646 could decrease cardiomyocyte hypertrophy (P<0.05) significangtly than that of PE.CBP mRNA expression of PE was significantly increased compared with Control (P<0.05),and this level was obviously inhibited by C646 (P<0.01).The immunofluorescence of Ki67 showed that PE could increase Ki67-positive cells obviously (P<0.01),and cardiomyocytes proliferation were inhibited (P<0.05) when CBP activity were suppressed.Conclusion:Aerobic exercise could promote myocardial proliferation through activating CBP.Cardiomyocytes proliferation was inhibited when CBP activity were suppressed.CBP plays an important role in the process of aerobic exercise promote cardiomyocytes proliferation.

aerobicexercise;cardiachypertrophy;cardiomyocyteproliferation;CBP

1002-9826(2016)05-0052-07

10.16470/j.csst.201605008

2015-07-18；

2016-06-01

胡玉龍(1975-)，女，湖南臨武人，副教授，博士，碩士研究生導師，主要研究方向為運動對心血管疾病的干預機制，Tel：(0514)87997109，E-mail：ylhu@yzu.edu.cn。

1.揚州大學 體育學院，江蘇 揚州 225127； 2.鎮(zhèn)江市體育科研所，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；3.揚州市第一人民醫(yī)院，江蘇 揚州 225001 1.Yangzhou University,Yangzhou 225127,China;2.Zhenjiang Research Institute of Sport Science,Zhenjiang 212000,China;3.Yangzhou First People’s Hospital,Yangzhou 225001,China.

G804.2

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