魚類腸道鐵載體高產(chǎn)菌株CB-EH-2的篩選與鑒定

李紅芳， 翟秋倩， 門晉名,2， 韓曉紅， 劉 麗， 李俊峰*

(1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042；2.迪沙藥業(yè)集團(tuán)，山東 威海 264200)

魚類腸道鐵載體高產(chǎn)菌株CB-EH-2的篩選與鑒定

李紅芳1， 翟秋倩1， 門晉名1,2， 韓曉紅1， 劉 麗1， 李俊峰1*

(1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042；2.迪沙藥業(yè)集團(tuán)，山東 威海 264200)

利用2216E限鐵培養(yǎng)基從青島近海海魚腸道內(nèi)篩選到1株鐵載體高產(chǎn)菌株，命名為CB-EH-2。結(jié)合形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA 基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析將其初步鑒定為Cobetiaamphilecti。鉻天青(CAS)法檢測其鐵載體的產(chǎn)生及對(duì)Fe3+的親和能力。XAD-2 大孔徑樹脂提取鐵載體，鐵載體類型和拮抗活性分析顯示，菌株CB-EH-2所產(chǎn)鐵載體為異羥肟酸型，可顯著抑制鰻弧菌等4種指示菌的生長。不同濃度2, 2′-聯(lián)吡啶及鐵離子對(duì)CB-EH-2的菌體量和鐵載體產(chǎn)量具有較大的影響。本文首次報(bào)道C.amphilecti產(chǎn)生異羥肟酸型鐵載體，CB-EH-2作為有益菌值得進(jìn)一步研究。

Cobetiaamphilecti；鐵載體；篩選；鑒定

水產(chǎn)品的抗生素或藥物殘留問題制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，從而使利用生態(tài)防治技術(shù)控制病原菌的生長成為養(yǎng)殖病害防治的研究重點(diǎn)[1]。生防技術(shù)往往是幾種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，其中競爭營養(yǎng)、附著位點(diǎn)或產(chǎn)生拮抗物質(zhì)是作用機(jī)制主要作用方式。大約1%～10%的魚腸道細(xì)菌通過分泌多肽、細(xì)菌素、過氧化氫、抗生素和/或有機(jī)酸抑制腸道內(nèi)其他微生物的生長[2]。鐵載體作為拮抗物質(zhì)的一種，在生防技術(shù)中受到廣泛關(guān)注。它是由生活在開放環(huán)境中的好氧和兼性厭氧微生物在缺鐵條件下，合成和分泌的一種小分子螯合物(<1 kDa)，能夠與鐵元素緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)鐵的吸收和運(yùn)輸，具有高度特異性，有利于微生物在鐵匱乏的環(huán)境中，與其他微生物競爭，獲取充足的鐵元素[3]。許多致病菌常常通過鐵載體從宿主體液的鐵結(jié)合蛋白來獲取鐵，然后通過特異性的細(xì)胞膜受體把鐵運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致宿主因缺鐵而得病[3]。有益微生物通過產(chǎn)生更高親和力的鐵載體螯合環(huán)境中的鐵來抑制致病菌生長[4-6]。實(shí)驗(yàn)表明熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)所產(chǎn)鐵載體可減少殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)引起的病害[7]，抑制鰻弧菌(Vibrioanguillarum)的生長[8]；橙色交替單胞菌(Alteromonasaurantia)[9]所產(chǎn)鐵載體可抑制魚類病原菌鰻弧菌w-1的生長。目前尚未見有關(guān)Cobetiaamphilecti分泌鐵載體的報(bào)道。本研究對(duì)青島近海海魚腸道鐵載體產(chǎn)生菌CB-EH-2進(jìn)行了生理生化和基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析；用XAD-2大孔徑樹脂色譜法獲得了其鐵載體粗品，并檢測了其鐵載體類型；同時(shí)驗(yàn)證了CB-EH-2分泌的鐵載體對(duì)部分養(yǎng)殖病原菌的拮抗效果，對(duì)其在防治魚類養(yǎng)殖病害中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 鐵載體產(chǎn)生菌CobetiaamphilectiCB-EH-2系本實(shí)驗(yàn)分離，指示菌鰻弧菌w-1由聯(lián)合國教科文組織中國海洋生物工程中心提供，燦爛弧菌4501由山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院提供，其他為本實(shí)驗(yàn)保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 ① 2216E培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸高鐵0.01 g，陳海水1 000 mL,pH 7.6,瓊脂 18 g)121 ℃滅菌20 min備用；去鐵固體培養(yǎng)基需加入30 g的8-羥基喹啉；液體培養(yǎng)基需用3%的8-羥基喹啉和三氯甲烷去鐵；② LB培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min備用；③ Y去鐵液體培養(yǎng)基：K2HPO42.0 g， (NH4)H2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，酵母粉1.0 g，酸水解酪蛋白1.0 g，蔗糖 10.0 g，NaCl 35.0 g，超純水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.6，并用8-羥基喹啉和三氯甲烷去鐵，121 ℃滅菌20 min備用；④ M9培養(yǎng)基：Na2HPO43.0 g，NaCl 5.0 g，NH4Cl 10.0 g，超純水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。冷卻后加入下列無菌組分：20%葡萄糖10.0 mL，1 mol/L MgSO42.0 mL，1 mol/L CaCl20.1 mL，10%去鐵水解酪蛋白20 mL。

1.1.3 主要試劑和儀器 Amberlite XAD-2 大孔樹脂(北京北實(shí)縱橫科技發(fā)展有限公司)；用于PCR 擴(kuò)增及其他分子生物學(xué)試劑(生工生物工程(上海)股份有限公司，即上海生工)。FBZ2002-UP標(biāo)準(zhǔn)試劑型超純水系統(tǒng)(青島富勒姆科技有限公司)；WFZ UZ-2000型紫外可見光分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；HZQ-Q全溫振蕩器 (哈爾濱市聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；Alphalmager EC凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech Corporation，USA)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選 從青島市姜戈莊碼頭購買近海捕撈的新鮮海魚，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，無菌處理后進(jìn)行解剖，取出完整魚腸，無菌海水沖洗2遍，稱重后，將腸道剪開，用少量無菌海水沖洗腸道2次，合并沖洗液；腸壁用無菌研缽研碎，加適量無菌海水。用無菌海水分別稀釋成10-1、10-2、10-3的稀釋液。分別從原液、10-1、10-2、10-3四個(gè)稀釋度中吸取100 μL樣品，涂布于去鐵2216E平板上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待菌落出現(xiàn)，觀察4個(gè)稀釋度下菌落的數(shù)目及種類，并計(jì)數(shù)。選擇形態(tài)一致的菌落通過Z字劃線法進(jìn)行純化，長出單菌落后，轉(zhuǎn)接2216E斜面，待菌苔形成后，放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 鐵載體的檢測和定量分析 用鉑金絲接種CB-EH-2的新鮮菌苔于去鐵2216E液體(0.16 μmol/L FeCl3)培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng) 48 h；發(fā)酵液經(jīng)10 000×g 離心10 min，取上清液。異羥肟酸的檢測采用Csáky[10]方法，兒茶酚類采用Arnow[11]方法，羧酸鹽類采用Shenker等[12]的方法進(jìn)行比色檢測。利用Schwyn和Neilands改進(jìn)的方法(CAS法)對(duì)上清液的鐵載體進(jìn)行定量檢測[13]，具體過程：上清液與CAS 檢測液等體積混合，充分混勻，靜置30 min后，測定630 nm處的吸光值(As)，未接種的2216E培養(yǎng)基作為對(duì)照調(diào)零，同時(shí)未接種的2216E培養(yǎng)基與等體積CAS 檢測液混合的吸光值作為參比值(Ar)，鐵載體活性單位的計(jì)算方式如下[14]：

鐵載體量(%)=((Ar-As)/Ar)×100%

1.2.3 菌株CB-EH-2的形態(tài)及生理生化特征 參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行觀察和鑒定。

1.2.4 16S rRNA基因的序列分析和數(shù)據(jù)處理 參照文獻(xiàn)[16]的方法提取菌株CB-EH-2基因組DNA，以 P1 (5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGCT-3′)和 P2 (5′-CTACGGCTACCTTG TTACGA-3′) 作為引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min。回收擴(kuò)增產(chǎn)物，與pUCm-T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑篩選法獲得陽性克隆，送上海生工測序。將測序結(jié)果用BLAST 軟件與GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性分析，并與數(shù)據(jù)庫中獲得的相近模式種16S rRNA基因序列用CLUSTAL W進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple alignments)分析[17]，用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算各序列遺傳距離，并通過自舉分析(Bootstrap)進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次[18]。

1.2.5 鐵載體的制備 鐵載體的制備參照文獻(xiàn)[19]的方法略有改進(jìn)。先把活化好的XAD-2 大孔徑樹脂加入1.2.2制備的無菌鐵載體上清液中，20 ℃、120 r/min振蕩過夜，CAS法測試上清液中鐵載體是否吸附完全。把吸附完成的XAD-2裝柱(3.0 cm×60.0 cm 玻璃層析柱)，先用超純水洗滌2個(gè)柱體積，除去未被吸附的雜質(zhì)和其他非鐵載體物質(zhì)，然后分別用25%、50%、75% 和100%的甲醇/水洗脫，流速0.3 mL/min，每個(gè)梯度100 mL，分步收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，各洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇和水并稱重。5 mL超純水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 抑菌活性的測定-擴(kuò)散法 接種指示菌于LB 或者2216E液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)過夜，取100 μL菌液均勻涂布于LB或者2216E平板上，將無菌濾紙片(d=6 mm)放置于涂有指示菌的平板上，取鐵載體粗品20 μL滴加到濾紙片上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.7 菌株CB-EH-2的特性研究 ①不同培養(yǎng)基對(duì)菌株CB-EH-2產(chǎn)鐵載體能力的影響：分別配制去鐵和不去鐵2216E液體培養(yǎng)基、Y去鐵液體培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基，250 mL三角瓶分裝50 mL培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min備用。接種等量CB-EH-2，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)，24 h取樣1次，每次3 mL，10 000×g離心10 min，取上清，連續(xù)取樣4次。通過CAS法測定鐵載體產(chǎn)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。②2,2-聯(lián)吡啶對(duì)菌株CB-EH-2產(chǎn)鐵載體能力的影響：向Y去鐵液體培養(yǎng)基中分別加入2, 2-聯(lián)吡啶，使最終濃度分別為0、50、100、200、300 μmol/L，121 ℃滅菌20 min備用。其他操作同①。③鐵離子濃度對(duì)菌株CB-EH-2產(chǎn)鐵載體能力的影響：向Y去鐵液體培養(yǎng)基中分別添加Fe3+，使其最終濃度分別為0、0.01、0.1、1、2 mmol/L，121 ℃滅菌20 min備用。其他操作同①。上述與鐵載體產(chǎn)生、檢測有關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用的試劑和培養(yǎng)基均用雙蒸去離子水配制，所有玻璃器具均在6 mol/L 鹽酸中浸泡3 d，并用雙蒸去離子水多次淋洗以除去痕量的鐵離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵載體高產(chǎn)菌株的篩選鑒定

采用CAS液體檢測法(圖1)，從青島近海海魚腸道內(nèi)篩選分離得到鐵載體量超過50%的菌株45株，其中，菌株CB-EH-2在缺鐵培養(yǎng)基中的鐵載體量高達(dá)84.12%，選擇該菌株進(jìn)行深入研究。CB-EH-2的菌落特征：乳黃色、凸起、圓形、表面濕潤、光滑(圖2)，菌體細(xì)胞呈短桿狀，革蘭染色陰性(圖2)。經(jīng)PCR擴(kuò)增，菌株CB-EH-2的16S rRNA基因序列經(jīng)純化處理后的片段長約1 446 bp，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，發(fā)現(xiàn)該菌株與鹽單胞菌科(Halomonadaceae)中Cobetia屬的多個(gè)不同種均具有99%相似性，結(jié)合生理生化和形態(tài)學(xué)特征將CB-EH-2初步鑒定為Cobetia屬。將CB-EH-2的16S rRNA基因序列與已報(bào)道Cobetia屬中幾個(gè)種的模式菌株16S rRNA基因序列，采用MEGA 5.1軟件 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，分析結(jié)果顯示，所分離的CB-EH-2與C.amphilecti形成的群的1 000次自舉分析(Bootstrap)置信度支持率達(dá)99%，因此，進(jìn)一步確定菌株CB-EH-2可能屬于C.amphilecti。

圖1 發(fā)酵上清液的CAS檢測Fig.1 The CAS assay of the supernatant 1：富鐵對(duì)照；2：富鐵發(fā)酵上清液；3：缺鐵對(duì)照；4：缺鐵發(fā)酵上清液；5：富鐵空白；6：缺鐵空白 1： the iron-rich media control； 2： the iron-rich supernatant； 3： the iron control； 4： the iron-deficient supernatant； 5： the iron-rich blank；6：the iron-deficient blank

圖2 菌株CB-EH-2的菌落(A)和菌體(B)形態(tài)Fig.2 The colony (A) and cell (B) of strain CB-EH-2

圖3 菌株CB-EH-2基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain CB-EH-2 and related type species based on the 16S rRNA gene sequences

2.2 鐵載體的類型檢測

采用鐵載體特異性檢測方法顯示Csáky法檢測結(jié)果為陽性，而其他鐵載體類型檢測反應(yīng)均顯陰性，說明菌株CB-EH-2所產(chǎn)鐵載體只有異羥肟酸一種類型。同時(shí)，以鹽酸羥胺為底物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過對(duì)菌株CB-EH-2的發(fā)酵上清液進(jìn)行分析檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)異羥肟酸類鐵載體的量達(dá)到了6.30 mg/L，為產(chǎn)鐵載體優(yōu)勢菌株。

2.3 鐵載體的制備及其抗菌作用

去細(xì)胞發(fā)酵上清液經(jīng)過XAD-2大孔徑樹脂吸附，去離子水洗滌后，分別用不同濃度的甲醇洗脫，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，超純水溶解，分別標(biāo)記為A、B、C和D，無菌水為對(duì)照(標(biāo)記為E)，再分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鰻弧菌w-1、燦爛弧菌4501為指示菌，檢測其抑菌活性，結(jié)果見圖4。樣品A、B無抑菌活性；樣品C僅能部分抑制大腸埃希菌和燦爛弧菌4501的生長；而樣品D對(duì)4種指示菌都有抑制作用，抑菌圈分別為16、16、12、10 mm，抑菌作用明顯，說明活性樣品主要集中在100%甲醇洗脫液中。

圖4 不同組分的抑菌結(jié)果

2.4 菌株CB-EH-2的特性研究

2.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株CB-EH-2產(chǎn)鐵載體能力的影響 不同培養(yǎng)基由于組分不同，對(duì)鐵載體的分泌也有一定的影響，為了獲得高鐵載體產(chǎn)量，分別考察了2216E去鐵和不去鐵培養(yǎng)基、去鐵Y培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基，結(jié)果如圖5所示。在發(fā)酵第3天，菌株CB-EH-2在去鐵Y培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基中鐵載體含量最高分別達(dá)到85.53%和79.07%；2216E去鐵培養(yǎng)基只有到第4天才達(dá)到36.40%；而在2216E不去鐵培養(yǎng)基中，菌株不產(chǎn)鐵載體。從發(fā)酵時(shí)間和鐵載體產(chǎn)量綜合考慮，隨后的實(shí)驗(yàn)均選擇Y去鐵培養(yǎng)基作為菌株CB-EH-2的發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株CB-EH-2 產(chǎn)鐵載體的影響Fig.5 Effect of different media on siderophore products of strain CB-EH-2

2.4.2 鐵離子濃度對(duì)菌株CB-EH-2產(chǎn)鐵載體能力的影響 在去鐵的Y培養(yǎng)基中加入不同濃度鐵離子，研究鐵離子對(duì)菌株CB-EH-2生長和產(chǎn)鐵載體的影響，結(jié)果如圖6、7所示。鐵離子濃度對(duì)菌株的菌體產(chǎn)量影響不大，只有當(dāng)鐵離子濃度超過2 mmol/L，菌體量才有所下降(圖6)，但對(duì)菌株的鐵載體產(chǎn)量有很大影響，當(dāng)鐵離子濃度超過10 μmol/L時(shí)，發(fā)酵液中鐵載體量明顯下降(圖7)，當(dāng)鐵離子濃度超過1 mmol/L時(shí)，48 h后發(fā)酵液中檢測不到鐵載體。菌株CB-EH-2鐵載體產(chǎn)量隨鐵離子濃度增加而減少的趨勢符合微生物對(duì)鐵離子吸收的規(guī)律，鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)只有在缺鐵條件下才能啟動(dòng)[3]。

圖6 不同鐵離子濃度對(duì)菌株 CB-EH-2生長的影響Fig.6 Effects of different concentrations of Fe3+on the growth of strain CB-EH-2

圖7 不同鐵離子濃度對(duì)菌株 CB-EH-2產(chǎn)鐵載體的影響Fig.7 Effects of different concentrations of Fe3+on the siderophore products of strain CB-EH-2

2.4.3 2, 2′-聯(lián)吡啶對(duì)菌株CB-EH-2產(chǎn)鐵載體能力的影響 在Y培養(yǎng)基中加入不同濃度的2, 2′-聯(lián)吡啶，考察其對(duì)菌株CB-EH-2菌體生長及鐵載體產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖8、9所示。當(dāng)2, 2′-聯(lián)吡啶濃度為50 μmol/L時(shí)，CB-EH-2在48 h的菌體產(chǎn)量最高，隨后，隨螯合劑濃度的增加，CB-EH-2的生長量(OD600)逐漸減小，當(dāng)其濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞停止生長(圖 8)，發(fā)酵液中也檢測不到鐵載體(圖9)。在低濃度(<100 μmol/L)時(shí)，發(fā)酵液中的鐵載體含量在24 h內(nèi)隨2,2′-聯(lián)吡啶濃度的增大而增加，且在100 μmol/L時(shí)最高，達(dá)到84.84%，隨后逐漸下降，但鐵載體量一直維持在較高水平(圖9)。說明培養(yǎng)基中添加微量的2,2′-聯(lián)吡啶(<100 μmol/L)，能夠刺激CB-EH-2菌體細(xì)胞生長并高產(chǎn)鐵載體，當(dāng)濃度過高時(shí)(>200 μmol/L)，可以抑制CB-EH-2菌體細(xì)胞生長且無鐵載體產(chǎn)生。

圖8 不同濃度的2,2′-聯(lián)吡啶對(duì)菌株 CB-EH-2生長的影響Fig.8 Effects of different concentrations of 2,2′-bipyridine on the growth of strain CB-EH-2

圖9 不同濃度的2,2′-聯(lián)吡啶對(duì)菌株CB-EH-2 鐵載體生成量的影響Fig.9 Effects of different concentrations of 2,2′-bipyridine on the siderophore products of strain CB-EH-2

3 討 論

本研究采用缺鐵平板從青島近海海魚腸道篩選得到1株能顯著抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鰻弧菌生長的鐵載體產(chǎn)生菌CB-EH-2，結(jié)合生理生化、形態(tài)學(xué)特征和基于16S rRNA基因序列分析等方法對(duì)CB-EH-2進(jìn)行了鑒定，但是由于Blast比對(duì)結(jié)果顯示CB-EH-2的16S rRNA基因序列與GenBank中Cobetia屬多個(gè)種的相似性都在99%，因此不能直接明確其在種水平的分類地位。本研究通過CB-EH-2的16S rRNA基因序列與Cobetia屬已報(bào)道種的模式菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)過分析明確了其分類地位(圖3)。

通過XAD-2 大孔徑樹脂吸附層析法獲得了CB-EH-2所產(chǎn)鐵載體粗品，與Julia等[20]所得結(jié)果相同，鐵載體主要集中在100%的甲醇洗脫液中，活性檢測發(fā)現(xiàn)其對(duì)4種指示菌都具有抑菌活性，與研究者之前對(duì)橙色交替單胞菌(A.aurantia)A18所做的研究結(jié)果相似[21]。同時(shí)，Wang等[6]也發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)所產(chǎn)鐵載體可以抑制海洋動(dòng)物病原菌鰻弧菌和副溶血弧菌的生長；用特異性方法檢測了其鐵載體類型，明確了其主要的功能基團(tuán)為羥肟基，但對(duì)其鐵載體的詳細(xì)結(jié)構(gòu)研究還需要借助液質(zhì)或氣質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等分析儀器[19]。

微生物是否分泌鐵載體與其所處環(huán)境中的鐵離子濃度密切相關(guān)。研究表明，多數(shù)微生物能夠在缺鐵環(huán)境中產(chǎn)生鐵載體，用于螯合環(huán)境中微量的鐵離子[22-23]，該現(xiàn)象在本研究中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，鐵離子濃度對(duì)CB-EH-2的菌體產(chǎn)量略有影響，但是對(duì)其鐵載體產(chǎn)量影響非常大，當(dāng)鐵離子濃度過多時(shí)，菌株不再分泌鐵載體，說明鐵載體只能在缺鐵的條件下產(chǎn)生，當(dāng)環(huán)境中的鐵離子濃度足夠其生長繁殖所用時(shí)，就不需要合成鐵載體[24-25]。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的2, 2′-聯(lián)吡啶進(jìn)一步驗(yàn)證了這一事實(shí)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與橙色交替單胞菌A18的特性一致[21]。

C.amphilecti是2013年報(bào)道的Cobetia屬的一個(gè)新種[26]，國外對(duì)該菌的研究目前也處于起步階段。已有研究表明，與其同屬的Cobetiamarina在污水處理與生物修復(fù)方面具有重要的應(yīng)用潛力[27-28]，C.marinaDSMZ 4741 和C.pacificaKMM 3879T可分泌結(jié)構(gòu)特殊的多糖[29-30]，但作為產(chǎn)鐵載體的優(yōu)勢菌株，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此對(duì)CB-EH-2在生物防治方面做進(jìn)一步的深入研究具有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值。

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Screening and Identification of High Sidero-Carrier High-Producing Bacteria CB-EH-2 from Intestinal Tracts of Marine Fish

LI Hong-fang1, ZHAI Qiu-qian1, MEN Jin-ming1,2, HAN Xiao-hong1, LIU Li1, LI Jun-feng1

(1.Coll.ofChem.Engin.,QingdaoUni.ofSci. &Technol.,Qingdao266042; 2.DishaPharm.Group,Weihai264200)

A high sidero-carrier high-producing bacterial strain was screened from the intestinal tracts of marine fish using iron-limited 2216E medium, and named as CB-EH-2, initially identified asCobetiaamphilectiwith morphological, physiological, and biochemical features, 16S rRNA gene sequence homology and phylogenetics analysis. The chrome azurol S (CAS) assay was used to detect the sidero-carrier production and its affinity to Fe3+. Sidero-carrier produced by CB-EH-2 were isolated from the cell-free culture supernatant by adsorption to Amberlite XAD-2 resin. Antagonistic activity and type of sidero-carrier from CB-EH-2 were analyzed. The results show that CB-EH-2 produced hydroxamate-type sidero-carrier against four indicator stains includingStaphylococcusaureus,E.coli,VibrioanguillarumandVibriosplendidus. Different concentrations of 2, 2′-bipyridine or Fe3+have a great influence on the growth and the sidero-carrier production of CB-EH-2.C.amphilectiwas the first reported to produce hydroxamate-sidero-carrier, and CB-EH-2 was worthy to study further as probiotic.

Cobetiaamphilecti; sidero-carrier; screening; identification

山東省高校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J14LE59)；青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(12-1-4-3-(3)-jch);山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF121030)

李紅芳 女，實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生。從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail: lihongfang@126.com

* 通訊作者。男，講師，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事海洋微生物活性物質(zhì)研究。Tel: 0532-84023030，E-mail:Lijf1999@qust.edu.cn

2015-08-08；

2015-09-14

Q939.1

A

1005-7021(2016)03-0032-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.006