三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)

王艷慧， 陶 妍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)

王艷慧， 陶 妍*

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

Crustin主要分布于甲殼動(dòng)物中，是一種富含半胱氨酸的小分子抗菌肽，在甲殼動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)crustin的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征可以將其分為不同的類型，本文以三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的PtCrustin2成熟肽為研究對(duì)象，通過構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，以期實(shí)現(xiàn)PtCrustin2成熟肽在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)。首先，從其鰓中提取總RNA，通過RT-PCR得到編碼PtCrustin2成熟肽的cDNA(mPtCrustin2)，并在其5′和3′端分別引入EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；然后將此片段與表達(dá)載體pPIC9K連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2；電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞后，以不同濃度的G418篩選到高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)和固化金屬離子親和層析(IMAC)分離，獲得了純化的重組體mPtCrustin2，Tricine-SDS-PAGE分析顯示其分子量約10.5 kDa；抑菌實(shí)驗(yàn)證明重組體mPtCrustin2對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有一定的抑菌效果。本研究首次實(shí)現(xiàn)了三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)，為進(jìn)一步研究提供參考。

三疣梭子蟹；mPtCrustin2成熟肽；畢赤酵母；重組DNA表達(dá)

Crustin主要分布于甲殼動(dòng)物中，是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，分子量為7～14 kDa；N端含有一個(gè)信號(hào)序列，C端含有一個(gè)WAP(whey acidic protein)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成一個(gè)含有4個(gè)二硫鍵的緊密包裹結(jié)構(gòu)，是crustin的主要功能域[1]。信號(hào)序列與WAP結(jié)構(gòu)域之間為可變區(qū)域，Smith等[2]根據(jù)可變區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異，將crustin分為三種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型crustin中，可變區(qū)域富含半胱氨酸；Ⅱ型crustin可變區(qū)域不僅富含半胱氨酸，且在信號(hào)序列附近有約40～80個(gè)甘氨酸；Ⅲ型crustin在信號(hào)序列與WAP結(jié)構(gòu)域之間含有一個(gè)短的富含PRP(脯氨酸-精氨酸-脯氨酸)的區(qū)域。Crustin作為一種抗菌因子在甲殼動(dòng)物先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，第一個(gè)crustin是在普通濱蟹(Carcinusmaenas)血細(xì)胞中分離到的，命名為carcinin，屬于Ⅰ型crustin，對(duì)革蘭陽性菌有抑菌活性[3]。近年來研究者對(duì)來自三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)血細(xì)胞和眼柄的I型crustin的3個(gè)同工型(PtCrustin1、PtCrustin2、PtCrustin3)進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們不僅對(duì)革蘭陽性的藤黃微球菌(Micrococcusluteus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有抑菌活性，而且對(duì)革蘭陰性的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)也有抑菌活性[4]。PtCrustin2主要在三疣梭子蟹的鰓和眼柄中表達(dá)，Cui等[4]克隆了三疣梭子蟹PtCrustin2的成熟肽基因，并通過大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組體PtCrustin2成熟肽。然而，迄今為止，關(guān)于crustin重組DNA表達(dá)方面的研究報(bào)道很少，尤其是基于真核重組表達(dá)的PtCrustin2的制備未見報(bào)道。本研究以三疣梭子蟹包含WAP結(jié)構(gòu)域的PtCrustin2成熟肽為研究對(duì)象，首先通過RT-PCR從三疣梭子蟹的鰓中克隆到編碼mPtCrustin2的cDNA片段，經(jīng)巢式PCR對(duì)其添加EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和6×his標(biāo)簽；以pPIC9K作為表達(dá)載體，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2；電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115后，通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組體mPtCrustin2，采用固化金屬離子親和層析(IMAC)法對(duì)其進(jìn)行純化和鑒定，并通過抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pMD19-T質(zhì)粒購自Takara公司(日本)，大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，pPIC9K表達(dá)載體和畢赤酵母GS115購自Invitrogen公司(美國)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso plus、TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ和NotⅠ均購自Takara公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、DNA分子量Marker和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自天根生化科技有限公司(北京)，引物合成和DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA和合成第一股cDNA 以三疣梭子蟹的鰓為材料，按照RNAiso Plus說明書提取總RNA。第一股cDNA合成如下操作：6 μL總RNA、1 μL Oligo dT Primer、1 μL dNTP、2 μL RNase free ddH2O，65 ℃保溫5 min，冰上迅速冷卻；依次加入4 μL 5×Prime Script Buffer、0.5 μL RNase Inhibiter、1 μL Prime Script RTase、4.5 μL RNase free ddH2O緩慢混勻；42 ℃保溫60 min；95 ℃保溫5 min。

1.2.2 PtCrustin2成熟肽基因的PCR擴(kuò)增和克隆 參考三疣梭子蟹PtCrustin2的全長cDNA序列(GenBank: JQ728435)，設(shè)計(jì)三對(duì)引物(表1)，通過巢式PCR(圖1)，得到添加EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)和6×his標(biāo)簽的PtCrustin2成熟肽基因。3次PCR的反應(yīng)條件如下：10×PCR Buffer 2 μL、dNTP 1.6 μL、正向和反向引物各0.8 μL、DNA模板0.5 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2 μL，無菌水加至20 μL；94 ℃變性3 min; 94 ℃預(yù)變性30 s，56 ℃(60 ℃)(61 ℃)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸5 min。第3次PCR產(chǎn)物割膠純化后與克隆載體pMD-19T進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pMD-19T-mPtCrustin2，將其轉(zhuǎn)至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜，通過菌落PCR挑取陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

注：下劃線表示EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)

圖1 通過PCR擴(kuò)增目的基因的策略圖Fig.1 Strategic map for PCR amplification of target gene

1.2.3 pPIC9K-mPtCrustin2重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 使用EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)pMD-19T-mPtCrustin2進(jìn)行雙酶切，得到含酶切位點(diǎn)的目的片段，將其與用同樣酶處理過的表達(dá)載體pPIC9K按1∶4(體積比)混合，在T4 DNA連接酶作用下，16 ℃反應(yīng)16 h后，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜。通過菌落PCR、EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切、DNA測序鑒定重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2是否構(gòu)建成功。

1.2.4 電轉(zhuǎn)入畢赤酵母及高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選 用SacⅠ對(duì)重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2進(jìn)行線性化處理，產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后以1∶8(體積比)與畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min；1.5 kV、25 μF、200 Ω，電擊5 ms，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇；30 ℃靜置2 h后，離心將菌體涂布于MD平板，30 ℃孵育至單菌落產(chǎn)生。挑取88個(gè)單菌落分別接種在含有0～4.0 mg/mL G418的YPD平板上，篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子；將篩選到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到MM平板和MD平板上，篩選甲醇利用快速型轉(zhuǎn)化子，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取酵母基因組DNA，并以此為模板，采用pPIC9K的通用引物5′AOX1和3′AOX1(表1)進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 重組體mPtCrustin2的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化和Western blot鑒定 將上述篩選到的高拷貝轉(zhuǎn)化子在BMG培養(yǎng)基中使用0.5%甲醇，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600為2～6；離心收集菌體，重懸于BMM培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)96 h，期間每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終體積的0.5%；離心收集上清，用作Tricine-SDS-PAGE分析(濃縮膠濃度4%、夾層膠濃度10%、分離膠濃度15.5%)和純化，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)由中科瑞泰生物科技有限公司(北京)提供。另一方面，將上清過0.22 μm濾膜后，采用賽多利斯切向流超濾器(VIVAFLOW 200)對(duì)其進(jìn)行濃縮脫鹽，再采用固化金屬離子親和層析(IMAC)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物溶于PBS緩沖液(pH=7.0)。純化的目的蛋白經(jīng)Tricine-SDS-PAGE后，將凝膠電轉(zhuǎn)至PVDF膜(100 V，1.5 h)，用TBST漂洗后加入封閉液封閉1 h；再用TBST漂洗后加入抗his標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫孵育2 h；再用TBST漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)，室溫孵育1 h；最終經(jīng)TBST漂洗后用DAB顯色液試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.6 重組體mPtCrustin2的活性檢測 以金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌為供試菌株，在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；取1 μL上述菌液，稀釋至50 μL，分別與50 μL純化目的蛋白和50 μL PBS緩沖液(陰性對(duì)照)混勻，37 ℃培養(yǎng)12 h，將此培養(yǎng)液涂于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后，觀察菌落情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR獲得目的基因及其克隆測序

提取三疣梭子蟹鰓的總RNA后，通過反轉(zhuǎn)錄合成第一股cDNA，并以此為模板進(jìn)行巢式PCR。如圖2所示，第1次PCR得到含mPtCrustin2序列及部分非編碼序列的397 bp的片段(圖2A)；第2次PCR得到5′端和3′端分別含EcoRⅠ和5×his標(biāo)簽的252 bp 的mPtCrustin2片段(圖2B)；第3次PCR得到5′端和3′端分別含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)、終止密碼子(TAA)和6×his標(biāo)簽的266 bp的目的片段(圖2C)。DNA測序結(jié)果與基因庫序列一致(圖3A)，由推斷的氨基酸序列可知，PtCrustin2成熟肽包含12個(gè)半胱氨酸殘基,在空間上可以形成6對(duì)二硫鍵,以維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和生物學(xué)功能。

圖2 目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of target gene M1、M2：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3：3次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物 M1,M2：DNA marker; 1, 2 and 3：PCR products for the first, second and third time respectively

圖3 mPtCrustin2的cDNA和推斷的氨基酸序列(A)及其重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2的構(gòu)建(B)Fig.3 cDNA and deduced amino acid sequences of mPtCrustin2 (A) and construction of the recombinant expression vector pPIC9K-mPtCrustin2 (B) *為終止密碼子，下劃線為限制性酶切位點(diǎn)，陰影為保守的半胱氨酸殘基 Stop code is shown by star, restriction endonucleases are underlined, and cysteine residues are shaded

2.3 構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2及其鑒定

采用EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)上述重組質(zhì)粒pMD-19T-mPtCrustin2和表達(dá)載體pPIC9K同時(shí)進(jìn)行雙酶切后，將mPtCrustin2片段與線性的pPIC9K連接，構(gòu)建pPIC9K-mPtCrustin2重組表達(dá)載體(圖3B)；轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，使用來自于目的片段上的引物(F3)和載體上的3′AOX1引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，以考察兩者是否連接成功。由圖4A可見，在約372 bp處有明顯條帶，與理論值相符；另一方面，從大腸埃希菌中提取重組質(zhì)粒pPIC9K-mPtCrustin2并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，由圖4B可見大、小分子量的2個(gè)條帶，位于較低位置處的條帶是mPtCrustin2，大小約為266 bp，另一個(gè)大分子量的條帶來自于載體。此外，DNA測序結(jié)果也證明mPtCrustin2與pPIC9K正確連接，未發(fā)生基因變異。

2.4 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及其鑒定

將重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞后，經(jīng)含不同濃度G418的YPD平板、MM平板和MD平板篩選后，獲得8株甲醇利用快速型高拷貝轉(zhuǎn)化子；經(jīng)YPD液體培養(yǎng)后，提取酵母基因組DNA，并以此為模板，使用載體上的通用引物5′AOX1和3′AOX1，通過PCR考察重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2是否與酵母基因組DNA嵌合。如圖5所示， 1～8是以含pPIC9K-mPtCrustin2的酵母基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物，9是以含pPIC9K空載體的酵母基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物。1～8號(hào)樣品均在約739 bp處有明顯條帶，與理論值相符；而9號(hào)樣品作為陰性對(duì)照，在約493 bp處有明顯條帶，由此證明pPIC9K-mPtCrustin2成功嵌合進(jìn)畢赤酵母基因組DNA。

2.5 在畢赤酵母中表達(dá)目的蛋白及其表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot鑒定

圖4 重組表達(dá)載體pPIC9K-mPtCrustin2的菌落 PCR (A)和雙酶切鑒定(B)Fig.4 Colony PCR (A) and restriction endonuclease digestion (B) identifications for the recombinant expression vector pPIC9K-mPtCrustin2M:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：菌落PCR產(chǎn)物；2：EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切產(chǎn)物M:DNA marker; 1：colony PCR product; 2：products digested by EcoRⅠand NotⅠ

將篩選到的高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子在BMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，期間不斷補(bǔ)加甲醇使其終濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)96 h后，通過離心分離收集上清。由Tricine-SDS-PAGE分析可見，在14.4～7.8kDa處有2個(gè)條帶(圖6A)，位于下方的那個(gè)條帶為mPtCrustin2，分子質(zhì)量約為10.5 kDa，符合表達(dá)產(chǎn)物的理論分子質(zhì)量，該表達(dá)產(chǎn)物因含限制性酶切位點(diǎn)和6×his標(biāo)簽以及信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，故較純粹的mPtCrustin2的分子質(zhì)量略高；而含pPIC9K空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清未發(fā)現(xiàn)清晰條帶。進(jìn)一步將收集的上清通過切向流超濾儀對(duì)其進(jìn)行濃縮脫鹽后采用IMAC層析法分離純化目的蛋白，如圖6B所示, 在14.4～7.8 kDa處有單一明顯條帶，與圖6A中顯示的目的蛋白位置相同，證明已獲得較高純度的目的蛋白。純化的15 mL蛋白質(zhì)溶液的濃度為0.35 mg/mL，推算其表達(dá)量為5.25 mg/L。另一方面，Western blot分析顯示(圖7)，在約10.5 kDa處有明顯條帶，與預(yù)測理論值相符，進(jìn)一步證明了目的蛋白被成功表達(dá)。

圖5 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.5 PCR identification for transformants containing multicopy gene insertionM:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～8:含pPIC9K-mPtCrustin2的酵母轉(zhuǎn)化子；9:含pPIC9K的酵母轉(zhuǎn)化子M:DNA marker；1～8:yeast transformants containing pPIC9K-mPtCrustin2; 9:yeast transformants containing pPIC9K

圖6 培養(yǎng)液上清(A)和純化產(chǎn)物(B)的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.6 Tricine-SDS-PAGE analysis for the supernatant (A) and purified productM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：培養(yǎng)96 h的上清；2：陰性對(duì)照；3：純化后的產(chǎn)物M:protein marker; 1：supernatant cultured for 96 h; 2:negative control; 3:purified product

圖7 純化產(chǎn)物的Western blot分析Fig.7 Western blot analysis for the purified productM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化后的產(chǎn)物；2:陰性對(duì)照M:protein marker; 1:purified product; 2:negative control

圖8 重組體mPtCrustin2的抑菌活性Fig.8 Antimicrobial activity of recombinant mPtCrustin2A：陰性對(duì)照；B：重組體mPtCrustin2A：negative control; B：recombinant mPtCrustin2

2.6 重組體mPtCrustin2的抑菌活性

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，A為PBS緩沖液(陰性對(duì)照)，2個(gè)平板上長滿菌落；而B圖的2個(gè)平板顯示重組體mPtCrustin2對(duì)革蘭陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭陰性的銅綠假單胞菌均有抑菌活性，但對(duì)后者的抑菌效果更好。

3 討 論

迄今為止，關(guān)于三疣梭子蟹PtCrustin2的重組DNA表達(dá)研究僅有原核表達(dá)的報(bào)道，且表達(dá)量很低[4]。本研究選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是基于其表達(dá)穩(wěn)定性高，能高效表達(dá)外源蛋白并具有翻譯后修飾功能，故有利于獲得具生物學(xué)活性的重組蛋白[5]，旨在為進(jìn)一步的擴(kuò)大制備和功能研究奠定基礎(chǔ)。通過構(gòu)建pPIC9K-mPtCrustin2真核重組表達(dá)載體，初步實(shí)現(xiàn)了三疣梭子蟹mPtCrustin2在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)，雖然表達(dá)量不高，但經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)初步確證重組體mPtCrustin2具有一定的抑菌活性。關(guān)于重組表達(dá)載體的構(gòu)建方面還有待進(jìn)一步的改進(jìn)，載體pPIC9K中α因子信號(hào)肽的N端存在Kex2和Ste13兩個(gè)切割位點(diǎn)，由于目的片段5′端所添加的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為EcoRⅠ，而EcoRⅠ與Kex2之間的序列導(dǎo)致重組體mPtCrustin2 N末端額外引入6個(gè)氨基酸；另外，Ste13因被切割效率不高，可能導(dǎo)致重組體的N末端氨基酸殘基稍有差異[6]，因此并未獲得天然的N末端。至于N末端額外引入的氨基酸是否對(duì)目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)活性產(chǎn)生影響還有待于進(jìn)一步的研究。

已有研究表明，對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化后可以提高目的蛋白的表達(dá)量[7-9]。由于本研究使用的編碼mPtCrustin2的基因是通過RT-PCR獲得的天然cDNA，對(duì)于畢赤酵母來說可能存在某些密碼子的限制，這可能是導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)量不太高的主要原因。經(jīng)檢測，96個(gè)密碼子中低頻密碼子的比例為6%，如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸等都是由低頻密碼子編碼，因此進(jìn)一步的研究將根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性，對(duì)目的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以期提高目的蛋白的表達(dá)量。另外，擬選擇pPICZαA替代pPIC9K，因pPICZαA分子量較小，長度僅為pPIC9K的1/3，轉(zhuǎn)化操作和染色體的整合相對(duì)容易[10]，通過采用合適的限制性內(nèi)切酶，可以獲得具有天然N末端的重組體mPtCrustin2。另一方面，以野生型的、對(duì)外源蛋白具有較好分泌和適應(yīng)能力的畢赤酵母X-33作為工程菌[11]，以期獲得高表達(dá)量的、具良好生物學(xué)活性的重組體mPtCrustin2。

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Expression of Swimming Crab (Portunustrituberculatus) PtCrustin2 Mature Peptide inPichiapastoris

WANG Yan-hui, TAO Yan

(ShanghaiEngin.Res.Ctr.ofAqua-Prod’tProcess. &Preserv’n,Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306)

Mainly distributing in crustaceans’ cells, crustins are small cysteine-rich antimicrobial peptides playing important roles in innate immune system of crustaceans. Crustins can be divided into several types according to their first structures. This paper takes PtCrustin2 mature peptide from swimming crab (Portunustrituberculatus) as researching target in order to realize recombinant DNA expression of the PtCrustin2 mature peptide inPichiapastoris, through the construction of aP.pastorisexpression system. First, total RNA was extracted from the gill of swimming crab. The cDNA encoding mPtCrustin2 mature peptide was amplified by RT-PCR, and inducedEcoRⅠandNotⅠrestriction endonuclease sites onto its 5′ and 3′ ends respectively. Then linked this target fragment onto the expression vector pPIC9K to construct the recombinant expression vector pPIC9K-mPtCrustin2, after it was e-transformed intoP.pastorisGS115 cell, and after screened and cultured with YPD medium containing different concentration of G418, high-copying yeast transformant was obtained and induced to express recombinant mPtCrustin2 through 0.5% methanol and immobilized metal affinity chromatography (IMAC) to isolate and obtained purified recombinant mPtCrustin2. Tricine-SDS-PAGE analysis indicated its molecular mass was 10.5 kDa. The inhibition experiment had proved that the recombinant mPtCrustin2 had a certain inhibition effect againstStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa. The present study for the first time realized the expression of recombinant DNA of mature peptide from swimming crab (P.trituberculatus) inP.pastoristhat lays foundation for further after-study.

swimming crab (Portunustrituberculatus)； mPtCrustin2 mature peptide；Pichiapastoris； recombinant DNA expression

上海市教育委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(15CXY30)；農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(UA201307)

王艷慧 女，碩士研究生。研究方向?yàn)樗a(chǎn)生物分子生物學(xué)。E-mail:pacawang2013@126.com

* 通訊作者。女，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樗a(chǎn)生物分子生物學(xué)。Tel: 021-61900384, E-mail:ytao@shou.edu.cn

2015-12-07；

2016-03-22

Q786

A

1005-7021(2016)05-0026-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.005