雌激素受體α、β及細胞周期蛋白D1、癌基因蛋白質(zhì)P21在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及臨床意義

胡觀麗，張晶波，董潔，胡勝男，劉建維，孟琳，王晴，張蓓

作者單位：1徐州醫(yī)科大學，a研究生學院，b臨床學院，江蘇 徐州 221004；2徐州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 徐州 221004；3徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇 徐州 221004；

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年增加，且發(fā)病年齡愈發(fā)年輕化［1-2］。子宮內(nèi)膜癌具有雌激素依賴性，超生理水平的雌激素與雌激素受體（ER）結(jié)合促進子宮內(nèi)膜細胞的過度增殖，進而在子宮內(nèi)膜癌的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要的作用［3］。雌激素受體具有ERα和ERβ兩種亞型，ERα和ERβ分別由不同的基因編碼，在細胞生物學功能方面可能發(fā)揮不同、甚至相反的作用［4］。已有的研究表明，ERα和ERβ在乳腺癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤中可能具有不同的表達模式［5-6］。ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中的表達也存在不一致的研究結(jié)果［7-8］。CyclinD1和癌基因蛋白質(zhì)P21作為細胞周期中重要的調(diào)控因子，均和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。本研究將通過檢測ERα、ERβ以及細胞周期調(diào)控因子CyclinD1、P21在子宮內(nèi)膜癌組織中的蛋白表達水平，分析以上蛋白在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的表達變化，進而探索ERα、ERβ以及細胞周期調(diào)控因子CyclinD1、P21在子宮內(nèi)膜癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2016年1月至2017年12月徐州市中心醫(yī)院婦科就診的子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生以及子宮肌瘤或腺瘤125例。采用隨機數(shù)字表法分為三組：（1）子宮內(nèi)膜癌組65例，通過手術(shù)取樣且經(jīng)過病理檢查確診。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009年）標準分期，I期35例，II期18例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例；高分化28例，中分化21例，低分化16例；肌層浸潤深度＜1/2病人35例，肌層浸潤深度≥1/2病人30例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例；組織病理類型為子宮內(nèi)膜樣55例，非子宮內(nèi)膜樣10例。（2）子宮內(nèi)膜不典型增生組30例，因功能失調(diào)性子宮出血行診斷性刮宮術(shù)，并且經(jīng)過病理確診。（3）正常子宮內(nèi)膜組30例，取自子宮肌瘤或腺肌瘤病人，通過全子宮手術(shù)切除獲得正常子宮內(nèi)膜。所有病人臨床病理資料完整，術(shù)前未行放療、化療及激素等治療，無合并癥及并發(fā)癥。所有納入研究的病人或其近親屬均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2免疫組織化學檢測免疫組織化學檢測所用到的ERα、ERβ、CyclinD1和P21一抗抗體均購于abcam公司。采用兔二步法檢測試劑盒（中衫金橋公司）進行，簡要步驟如下：子宮內(nèi)膜組織標本在10%甲醛中浸泡固定，石蠟包埋，連續(xù)3～4 μm切片。石蠟切片梯度乙醇脫蠟后進行高壓、高溫抗原修復，加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。ERα、CyclinD1和P21一抗抗體與PBS按照1∶200稀釋，ERβ一抗抗體與PBS按照1∶50稀釋后，分別滴加到標本上，4度過夜孵育。加入二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，封片觀察。預實驗中陽性染色的切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3免疫組織化學結(jié)果判定免疫組織化學染色結(jié)果由2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法對染色結(jié)果進行判讀計分。ERα、ERβ、CyclinD1和P21陽性染色均主要定位于細胞核，出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色。在顯微鏡（×400）下隨機觀察10個高倍鏡視野，每個視野觀察100個細胞，找出陽性細胞個數(shù)，計算陽性率。以陽性細胞百分比進行如下劃分：陽性細胞數(shù)＜10%為（-），10%～25%為（+），26%～75%為（++），＞75%為（+++）。最終判定標準：（-）記為陰性，（+）、（++）、（+++）均記為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗比較各組間蛋白陽性表達率之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1ERα、ERβ、CyclinD1和P21蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達差異我們通過免疫組化檢測了ERα、ERβ、CyclinD1和P21四種蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERα、ERβ、CyclinD1和P21蛋白在三組間的陽性表達率均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但各個蛋白在三組間的表達變化趨勢不同。ERα在三組間的陽性表達率依次為：子宮內(nèi)膜不典型增生＞正常子宮內(nèi)膜＞子宮內(nèi)膜癌，ERβ和P21在三組間的陽性表達率依次為：正常子宮內(nèi)膜＞子宮內(nèi)膜不典型增生＞子宮內(nèi)膜癌，CyclinD1在三組間的陽性表達率依次為：子宮內(nèi)膜癌＞子宮內(nèi)膜不典型增生＞正常子宮內(nèi)膜（表1）。

2.2ERα和ERβ蛋白表達與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性我們分析了ERα和ERβ蛋白表達水平與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERα與病理分期、分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型均有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ERα在Ⅲ～Ⅳ期、低分化、肌層浸潤深度≥1/2以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達率降低，且在子宮內(nèi)膜樣組織中具有較高的陽性表達率。ERβ與病理分期有關(guān)，在Ⅲ～Ⅳ期組織中的陽性表達率低于Ⅰ～Ⅱ期病人，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但是與ERα不同，ERβ與分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型均無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）（表2）。

2.3CyclinD1和P21蛋白表達與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性我們進一步分析了細胞周期因子CyclinD1和P21蛋白表達水平與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CyclinD1與分化程度和肌層浸潤深度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。P21與病理分期、分化程度和肌層浸潤深度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CyclinD1在低分化和肌層浸潤深度≥1/2的子宮內(nèi)膜癌組織中具有較高的陽性表達率，而P21與之相反，在Ⅰ～Ⅱ期、高中分化以及肌層浸潤深度＜1/2的組織中具有較高的陽性表達率（表3）。

3 討論

雌激素受體是一種廣泛存在于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分子，受到雌激素的激活進而發(fā)揮生物學功能［11］。經(jīng)典的雌激素核受體主要包括ERα和ERβ，分別由ESR1和ESR2兩種不同的基因編碼［11］。盡管ERα和ERβ在多種組織中陽性表達，但是研究發(fā)現(xiàn)ERα和ERβ卻有著不同的表達模式。例如，ERα在子宮內(nèi)膜細胞、乳腺癌細胞以及卵巢間質(zhì)細胞中陽性表達，而ERβ則在卵巢顆粒細胞、內(nèi)皮細胞以及腎臟、骨骼等組織中廣泛表達［12］。在細胞生物學功能方面，ERα和ERβ也具有不同的生物學效應(yīng)。研究表明，ERα在乳腺癌和肝癌細胞中可以介導雌激素誘導的促有絲分裂信號，促進腫瘤細胞的增殖［13-14］；而Strom等研究發(fā)現(xiàn)ERβ可以抑制雌激素對乳腺癌細胞的促增殖作用［15］；Bossard等［16］對卵巢癌體內(nèi)外的研究顯示，ERβ表達可以減少磷酸化AKT、CyclinD1，從而影響卵巢癌細胞周期以及促進凋亡。由此可見，ERα可以介導雌激素的促增殖作用、ERβ則介導雌激素的促凋亡效應(yīng)。

表1 ERα、ERβ、CyclinD1和P21蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織的表達/例（%）

表2 ERα和ERβ蛋白表達與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性/例（%）

在子宮內(nèi)膜癌研究領(lǐng)域中，國內(nèi)外有關(guān)ERα的研究較多，ERβ相關(guān)研究相對較少。但ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中的表達變化依然存在不一致的結(jié)果。例如，Knapp等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中均表達上調(diào)。而袁俐等研究表明ERα在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達率低于正常組織［17］；姚微等研究也表明ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中表達下調(diào)，且ERβ表達下調(diào)可能是由啟動子區(qū)域甲基化所介導［18］。因此，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達模式還有待于進一步證實。

表3 CyclinD1和P21蛋白表達與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性/例（%）

我們的研究發(fā)現(xiàn)，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達率均低于正常子宮內(nèi)膜組織。有趣的是，與正常子宮內(nèi)膜相比，ERα在子宮內(nèi)膜不典型增生組織中陽性表達率上調(diào)，而在子宮內(nèi)膜癌組織中卻出現(xiàn)較低的陽性表達率。子宮內(nèi)膜不典型增生是子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，部分不典型增生經(jīng)過較長時間后可以進展為子宮內(nèi)膜癌［19］。ERα在子宮內(nèi)膜不典型增生組織中陽性表達率高于正常組織，提示ERα可能在子宮內(nèi)膜癌早期腫瘤形成過程中發(fā)揮著促癌的作用。進一步，我們通過分析ERα和ERβ子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ERα在I～II期、高中分化的子宮內(nèi)膜癌病人組織中陽性表達率依然較高，而主要在Ⅲ～Ⅳ期以及低分化的子宮內(nèi)膜癌病人組織中出現(xiàn)較低的陽性表達率。說明ERα可能在早期子宮內(nèi)膜癌病人組織中陽性表達率依然較高，僅在晚期子宮內(nèi)膜癌中表達降低。因此我們推測，在子宮內(nèi)膜不典型增生以及早期子宮內(nèi)膜癌中，ERα可能通過介導雌激素活性進而扮演著促癌的角色；在子宮內(nèi)膜癌進展為晚期的過程中，由于腫瘤異質(zhì)性以及ERα對雌激素敏感性的改變，出現(xiàn)更多ERα陰性表達的子宮內(nèi)膜癌細胞，間接導致ERα蛋白陽性表達率降低。ERβ在子宮內(nèi)膜不典型增生以及子宮內(nèi)膜癌病人組織中均呈現(xiàn)低表達，提示ERβ不同于ERα，在子宮內(nèi)膜癌腫瘤形成及進展過程中可能具有抑癌基因的作用。ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中具體的生物學功能還有待于進一步的細胞生物學及分子生物學功能的研究確認。

CyclinD1和P21蛋白均為調(diào)節(jié)細胞周期的相關(guān)蛋白，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復合物，促進細胞周期G1期進入S期，促進腫瘤細胞增殖；P21蛋白則可作為細胞周期抑制蛋白，使細胞周期停滯在G1期，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20］。研究表明，CyclinD1可以作為腫瘤進展惡化的分子標志物，而P21則可以作為腫瘤病人良性預后的標志物［21-22］。因此，我們還探討了CyclinD1和P21在子宮內(nèi)膜癌中的表達及臨床意義。我們發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達率升高，P21在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達率則降低；CyclinD1陽性表達與子宮內(nèi)膜癌分化程度及肌層浸潤深度正相關(guān)，而P21則與病理分期、分化程度以及肌層浸潤深度負相關(guān)。在較早的研究中，廖秀芳等發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達，且在低分化、有淋巴轉(zhuǎn)移以及晚期子宮內(nèi)膜癌組織中過度表達［9］；韋瑞紅等研究發(fā)現(xiàn)，P21在正常子宮內(nèi)膜-不典型增生-子宮內(nèi)膜癌進展過程中表達依次降低［10］。我們的結(jié)果與之類似，均提示在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中，CyclinD1在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮促進癌癥形成及進展的作用，P21在子宮內(nèi)膜癌中則可能發(fā)揮抑制癌癥形成及進展的作用。有研究表明，二甲雙胍可以顯著下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞ERα的表達而上調(diào)ERβ的表達，并進一步抑制雌激素誘導的子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖［23］。此外，二甲雙胍對腫瘤細胞增殖凋亡的影響可能與CyclinD1和P21等細胞周期調(diào)控因子有關(guān)［24］。因此，在子宮內(nèi)膜癌中，CyclinD1和P21有可能作為ERα、ERβ下游的細胞周期調(diào)控因子，但是ERα、ERβ能否直接調(diào)控CyclinD1、P21的表達還有待于進一步研究。

本研究也存在一定的局限性。由于組織樣本收集受到病人例數(shù)、病人是否愿意參與研究等因素的影響，因此本研究納入的病例與對照的樣本量有限，尤其按照臨床特征分組后各組樣本量變小，較小的樣本量可能不能保證足夠的統(tǒng)計效能。因此在我們后續(xù)的研究中，將增加組織樣本的收集，對ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達模式進行進一步的驗證。

綜上所述，本研究顯示，ERα和ERβ在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生以及子宮內(nèi)膜癌組織中可能具有不同的表達模式，ERα和ERβ可能在子宮內(nèi)膜癌腫瘤形成及進展過程中發(fā)揮不同的作用。深入了解ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展各個階段的生物學作用和機制，可能為子宮內(nèi)膜癌的精準治療提供有效的靶點和思路。