外用鹿茸膏劑抗小鼠皮膚衰老的實(shí)驗(yàn)研究

郁兵，何鳳琴，楊章民

作者單位：1西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065；2陜西師范大學(xué)生命科學(xué)院，陜西 西安 710061

鹿茸是梅花鹿或馬鹿的成年雄鹿處于生長(zhǎng)期、未骨化的幼角，是一味被祖國(guó)醫(yī)學(xué)數(shù)千年實(shí)踐所驗(yàn)證的名貴中藥，其性溫、咸，味甘，具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋健骨、調(diào)沖任、托瘡毒的作用［1］。鹿茸在生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)速度很快，最多每天可以生長(zhǎng)1～2 cm，其原因在于內(nèi)部含有大量復(fù)雜的生物活性物質(zhì)。近年來(lái)對(duì)中藥材抗衰老的研究非常多，如：人參、黃芪、枸杞、黃精等，現(xiàn)代生物學(xué)對(duì)鹿茸的研究也證明了鹿茸具有抗衰老功效［2-5］，但是對(duì)應(yīng)用鹿茸全組份抗皮膚衰老的研究并不多見。本文作者認(rèn)為，鹿茸是一種成分非常復(fù)雜的中藥材，其抗衰老很可能是多種組份互相協(xié)同產(chǎn)生的功效，本課題自2018年1月至2019年5月研究外用鹿茸抗皮膚衰老的功效，為進(jìn)一步將鹿茸開發(fā)成抗皮膚衰老化妝品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性昆明種小鼠30只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001，合格證號(hào)：61001700003029。由于本研究最終目的是為了研制適用于女性的抗皮膚衰老化妝品，所以全部選用雌性小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。小鼠的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)原則。

1.2 試驗(yàn)藥物和主要試劑成年梅花鹿茸最多可以分枝兩次，第一次分枝后叫做二杠茸，該階段是鹿茸生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，粗灰分含量低，含有較多活性物質(zhì)。根據(jù)鹿茸不同部位組織特征的差異，鹿茸切片由頂端向下依次為蠟片、粉片、血片和骨片，越靠近頂端的茸片，品質(zhì)越高。試驗(yàn)用鹿茸由本課題組成員到項(xiàng)目合作方銅川鹿苑實(shí)業(yè)有限公司現(xiàn)場(chǎng)割取，并取其中下部顏色鮮紅、血液豐富的切片——血片為試驗(yàn)藥物。血片靠近鹿茸基部，品質(zhì)中下，能夠代表鹿茸的基本藥效［6］。

HA測(cè)定試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；HYP測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；SOD測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；D-半乳糖，上?；瘜W(xué)試劑二廠；考馬斯亮蘭，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器超微量微孔板分光光度計(jì)（Epoch，美國(guó)Bio-Tek公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（SF-TGL-16GS，上海菲恰爾分析儀器有限公司）；冷凍干燥儀（CTAL PH2-4/LSC，德國(guó)CHRIST公司）；遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱（YHG-400-S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；恒溫水浴鍋（SHHW21.420AⅡ，天津市泰斯特儀器有限公司）；粉碎機(jī)（FSJ-A05N6，廣東小熊電器有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組與造模 首先將雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，保證小鼠適應(yīng)現(xiàn)環(huán)境后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將30只雌性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分組的方法分成5組，其中4組小鼠作為造模組，皮下注射D-半乳糖1.0 g·kg-1·d-1，一共注射30 d；余下一組小鼠作為空白組，每天注射同體積生理鹽水［7-9］。30 d后造模組和空白組皮膚外觀比對(duì)，模型組明顯皮膚松弛，出現(xiàn)細(xì)密皺紋，而空白組則相反，見圖1。

圖1 皮膚衰老模型的建立：A為空白組小鼠；B為模型組小鼠

將4組皮膚衰老模型小鼠分為：模型組、鹿茸膏劑A、B、C組。用剪刀將小鼠背部毛發(fā)剪短，再用剃須刀剃毛備用。

1.4.2制備鹿茸膏劑 將鹿茸血茸片100 g剪切成碎片，粉碎機(jī)高速檔粉碎10次，每次1 min。精確稱取粉碎后的鹿茸組織和凡士林，充分?jǐn)嚢杌靹?，配制成模型組（0%）、鹿茸膏劑A組（5%）、鹿茸膏劑B組（10%）、鹿茸膏劑C組（15%）4個(gè)濃度鹿茸膏劑各50 g，置于冰箱冷藏室中保存。

1.4.3皮膚外用鹿茸膏劑 選取小鼠背部中央位置4 cm×7 cm的區(qū)域，將各組膏劑涂抹在對(duì)應(yīng)各組小鼠選取的皮膚區(qū)域表面，每只每天涂抹0.3 g，24 h后清潔皮膚并再次涂抹，連續(xù)涂抹21 d，期間還需手工脫毛4次。

1.4.4小鼠皮膚的表觀特征觀察 比對(duì)各組小鼠用藥部位皮膚的色澤、光滑程度、皺紋等表觀特征并拍照記錄。然后脫頸法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，迅速剝下用藥部位皮膚，去除皮下脂肪和其他結(jié)締組織，鋪平后用直徑2 cm打孔器在正中位置切取小鼠皮膚用于含水率測(cè)定，余下的皮膚于-20℃冷凍保存，用于測(cè)定HYP等成分。

1.4.5皮膚含水率的測(cè)定 精確稱量打孔器切取的皮膚濕重，隨即將其放入烘箱中，于50℃烘干12h，然后稱取干重，計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組皮膚含水率。公式如下：

1.4.6皮膚羥脯氨酸（HYP）含量測(cè)定 取涂藥部位皮膚組織0.5 g，用冰浴預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行漂洗，濾紙擦干，加入冰浴預(yù)冷的生理鹽水，使用玻璃勻漿器研磨成濃度為10%的勻漿液。將得到的勻漿液在0℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照HYP試劑盒說(shuō)明書所示方法，使用超微量微孔板分光光度計(jì)測(cè)定OD值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚HYP含量。

1.4.7皮膚透明質(zhì)酸（HA）含量測(cè)定 取涂藥部位皮膚組織0.5 g，加入冰浴預(yù)冷的PBS緩沖溶液，使用玻璃勻漿器研磨成濃度為10%的勻漿液。將得到的勻漿液在0℃下1 000 r/min離心4 min，取上清液。按照HA試劑盒說(shuō)明書所示方法，使用超微量微孔板分光光度計(jì)測(cè)定OD值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚HA的含量。

1.4.8皮膚超氧化物歧化酶（SOD）活力的測(cè)定 取涂藥部位皮膚組織0.5 g，用冰浴預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行漂洗，之后加入冰浴預(yù)冷后的生理鹽水，使用玻璃勻漿器研磨成濃度為10%的勻漿液。將得到的勻漿液在0℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照SOD試劑盒說(shuō)明書所示方法，使用超微量微孔板分光光度計(jì)測(cè)定OD值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚SOD活力。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示；組間比較采用單因素方差分析；方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果顯著，兩兩比較采用Dunnett T3檢驗(yàn)；方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 五組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的測(cè)定/±s

表1 五組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的測(cè)定/±s

注：與模型組相比較，aP＜0.01，bP＜0.05

?組別鼠數(shù)皮膚含水率/%羥脯氨酸含量/（μ g/m g）透明質(zhì)酸含量/（μ g/m L）S O D活力/（U/m g）空白組模型組鹿茸膏劑A組鹿茸膏劑B組鹿茸膏劑C組F值P值事后檢驗(yàn)（兩兩比較）6 6 6 6 6 7 5.4 4±0.7 3 a 5 7.7 2±0.8 9 6 6.2 2±1.2 1 b 6 8.8 2±0.6 4 a 7 0.7 0±1.0 5 a 3 8 4.3 3 0.0 0 0 L S D 4.1 6 8±0.0 6 a 3.6 0 4±0.2 0 3.8 5 0±0.3 8 3.9 5 6±0.1 2 b 4.0 8 0±0.1 2 a 1 0.8 4 0.0 0 0 D u n n e t t T 3 9.2 7 3±0.2 9 a 6.1 6 3±0.5 4 6.1 6 4±0.8 0 8.5 1 4±0.6 3 b 9.0 2 4±0.2 4 a 2 5 4.2 0 9 0.0 0 0 D u n n e t t T 3 3 6 5.8 0±1 6.2 5 9 a 3 0 4.8 4±1 2.0 2 6 3 3 8.3 6±7.8 4 8 b 3 5 3.1 2±5.9 6 4 a 3 5 7.2 0±1 0.6 3 4 a 3 4.9 7 5 0.0 0 0 L S D

2 結(jié)果

2.1 皮膚外觀比較觀察各組小鼠皮膚發(fā)現(xiàn)：與空白組動(dòng)物比較，模型組小鼠皮膚松弛，有大量褶皺，體毛再生較慢。涂抹了鹿茸膏劑的三組小鼠與模型組相比，在皮膚褶皺、光滑、松弛等方面都有較為明顯的改善，改善效果隨鹿茸含量增高而增強(qiáng)，以鹿茸膏劑C組最佳，結(jié)果見圖2。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚外觀的比較：A為模型組；B為鹿茸A組；C為鹿茸B組；D為鹿茸C組

2.2 鹿茸對(duì)小鼠皮膚含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的影響測(cè)定五組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力測(cè)定結(jié)果見表1。模型組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力均顯著低于空白組（P＜0.01），說(shuō)明小鼠的皮膚衰老模型造模成功。鹿茸膏劑A組在皮膚含水率和SOD活力方面顯著高于模型組（P＜0.05），在HYP和HA含量方面與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。鹿茸膏劑B組在皮膚含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力方面顯著高于模型組（P＜0.05），在皮膚含水率和SOD活力方面和模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。鹿茸膏劑C組在皮膚含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力方面和模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組小鼠的皮膚光滑，較為緊致，富有彈性。注射D-半乳糖的皮膚衰老模型小鼠皮膚松弛，皺褶大量增多，在皮膚含水率、羥脯氨酸含量、透明質(zhì)酸含量、超氧化物歧化酶活力等指標(biāo)明顯下降。經(jīng)測(cè)定，模型小鼠在外用鹿茸膏劑后，10%和15%濃度鹿茸膏劑組小鼠皮膚外觀改善的效果明顯，而且這兩個(gè)濃度組小鼠皮膚的含水率、透明質(zhì)酸含量、羥脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活力等指標(biāo)也得到了顯著提高。

衰老機(jī)制的假說(shuō)有很多，一般認(rèn)為，自由基普遍存在機(jī)體內(nèi)，隨著機(jī)體的衰老，皮膚組織具有抗氧化功能的過(guò)氧化物歧化酶等成分含量下降，導(dǎo)致自由基大量積累，過(guò)量的自由基會(huì)過(guò)氧化蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等細(xì)胞成分，從而破壞細(xì)胞膜、線粒體、染色體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)交聯(lián)變性和DNA鏈斷裂；而皮膚成纖維細(xì)胞功能的衰退，會(huì)引起羥脯氨酸生成減少，膠原蛋白合成減少，透明質(zhì)酸含量下降。這些傷害在皮膚組織學(xué)方面表現(xiàn)為：表皮和真皮層變薄，真皮內(nèi)的膠原蛋白減少，透明質(zhì)酸含量下降，皮膚含水率下降，膠原纖維交聯(lián)，脂褐素堆積；于是皮膚外觀出現(xiàn)干燥、松弛、皺紋、暗沉等衰老癥狀［10-11］。

鹿茸本身就是處于快速生長(zhǎng)階段的幼角，因此內(nèi)部含有大量促進(jìn)組織生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，鹿茸的成分包括蛋白多肽類、氨基酸、糖類、生物胺類、甾體類、脂類和無(wú)機(jī)元素。蛋白多肽類是鹿茸最主要的活性成分，與抗衰老有關(guān)的主要是酶類和生長(zhǎng)因子類。酶類包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、單胺氧化酶（MAO）等，這些酶類具有抗氧化、抗衰老作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等能夠促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的功能，增加膠原蛋白和透明質(zhì)酸的合成。鹿茸中的糖類包括硫酸軟骨素、酸性黏多糖、中性糖、半乳糖胺等，這些成分往往具有抗氧化或者保濕的作用。鹿茸多胺可以抗脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成。鹿茸中的甾體類包括雌二醇、膽甾醇、5a-雄甾烷-1，3-二酮、睪丸酮、膽甾-3，5-二烯，5a-膽甾-7-烯-3-酮等成分，這些激素類成分能夠抑制黑色素細(xì)胞絡(luò)氨酸酶活性、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和增加膠原蛋白和透明質(zhì)酸合成、抑制炎癥形成、延緩皮膚衰老［12-15］。由此可見，鹿茸所含活性成分復(fù)雜多樣，其抗衰老是多種組份互相協(xié)同產(chǎn)生的功效，而且外用全組分鹿茸，可以起到很好的抗皮膚衰老的效果。本研究證明，鹿茸可能是一種良好的抗皮膚衰老的天然藥物。

（本文圖1，2見插圖9-1）