GHSR1a shRNA慢病毒載體的構建及其對體內(nèi)直腸癌生長和凋亡的影響

摘要：目的 探討GHSR1a shRNA慢病毒載體的構建及其對體內(nèi)直腸癌生長和凋亡的影響。方法 構建特異性靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表達載體和陰性對照序列慢病毒載體；通過慢病毒感染建立穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的SW480細胞（KD）、陰性對照細胞（NC）及空白對照細胞（BC），RT-PCR檢測GHSR1a mRNA在細胞中的表達；建立裸鼠直腸癌SW480細胞皮下移植瘤模型，實驗結束后處死裸鼠并測量各組裸鼠腫瘤重量；免疫組織化學法檢測腫瘤組織中Ki-67的陽性表達，TUNEL法檢測細胞凋亡。結果 在體外實驗中，通過熒光表達情況及流式細胞學結果表明成功建立穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的SW480細胞；SW480細胞感染GHSR1a shRNA后，KD組細胞中GHSR1a mRNA的表達明顯高于BC組或NC組（P< 0.001）；在體內(nèi)實驗中，KD組裸鼠直腸癌皮下移植瘤重量明顯低于BC組或NC組（P=0.011）；KD組移植瘤細胞凋亡指數(shù)明顯高于BC組或NC組（P<0.001），同時Ki-67在KD組移植瘤細胞中的陽性表達顯著低于BC組或NC組（P<0.001）。結論 成功建立穩(wěn)定感染GHSR1a shRNA的直腸癌SW480細胞，沉默GHSR1a后對體內(nèi)人直腸癌細胞生長有明顯抑制作用，并促進細胞凋亡，表明GHSR1a基因有可能成為新的直腸癌治療作用靶點。

關鍵詞：直腸癌；GHSR1a；shRNA

Construction of shRNA Lentiviral Vector of GHSR1a Gene and Its Effect on the Proliferation and Apoptosis of Rectal Cancer Cells in Vivo

HUANG Cheng-gang，CAI Xue-hong，XU Jia，ZHANG San-jun

（Department of Gastrointestinal Surgery， The First People Hospital of Yueyang， Yueyang 414000，Hunan，China）

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effects of lentivirus-mediated shRNA targeting of Growth Hormone Secretagogue Receptor 1a （GHSR1a） in rectal cancer cell line SW480 in vivo. Methods Human GHSR1a sequence was used for the design of shRNA targeting GHSR1a， which was then introduced to lentivirus， followed by transfection into SW480 cells. Real time quantitative PCR （RT-PCR） was performed to detect the mRNA expression of GHSR1a in rectal cancer cells. In vivo studies， the stable silencing GHSR1a in SW480 xenografts in nude mice were established. After the mice were sacrificed and weighted， immunohistochemistry （IHC） was used to detect the positive expression of Ki-67 in the tumors. TUNEL test kit was used to explore cellular apoptosis in the tumor tissues. Results In vitro study， the tumor-specic lentivirus mediated shRNA targeting GHSR1a gene and GHSR1a knockdown SW480 cells were successfully constructed by fluorescence and flow-cytometry. After transfection with GHSR1a shRNA， the mRNA level of GHSR1a was markedly inhibited in SW480 cells compared with the blank control （BC） or negative control （NC）， the difference was statistically significant （P < 0.001）. In vivo results demonstrated that down-regulation of GHSR1a in SW480 cells significantly decreased the expression of Ki-67 in tumor tissues （P < 0.001）， leading to a marked reduction in tumor weight in comparison to BC or NC tumors （P = 0.011）. In addition， apoptosis occurred more frequently in the GHSR1a shRNA transfection group than in control groups （P < 0.001）. Conclusion Down-regulation of GHSR1a by shRNA technology can effectively inhibit proliferation and promote apoptosis of SW480 cells in vivo， silencing GHSR1a expression could become a novel therapeutic strategy for rectal adenocarcinoma prevention and treatment in the future.

Key words：Rectal cancer； GHSR1a； shRNA

生長激素促泌劑受體（Growth Hormone Secretagogue Receptors，GHSRs）作為腦腸肽激素（ghrelin）的內(nèi)源性受體，在機體中可產(chǎn)生廣泛的生物學效應[1]。研究表明，ghrelin通過GHSRs從而發(fā)揮調(diào)控作用，目前已知的GHSRs有GHSR1a和GHSR1b兩個亞型[2]。近年來報道稱ghrelin/GHSRs生物學軸不僅調(diào)控正常細胞生長和分化，同時與多種惡性腫瘤細胞生長和轉移等惡性生物學行為關系密切[3-5]。但GHSR1a在直腸癌中的作用機制仍待進一步研究。為此，本研究應用RNA干擾技術，構建靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表達載體，感染至人直腸癌SW480細胞中，并建立裸鼠直腸癌皮下移植瘤模型，觀察沉默GHSR1a基因對體內(nèi)直腸癌細胞生長和凋亡的作用，探討GHSR1a作為直腸癌潛在治療靶點的作用價值。

1 資料與方法

1.1試劑 胎牛血清（FBS）、含EDTA胰酶和高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、Lipofectamine2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和細胞蛋白提取試劑盒購自美國Fermentas公司；RT-PCR 試劑盒購自日本TaKaRa株式會社；慢病毒載體系統(tǒng)pLenR-GPH vector由上海吉凱基因技術有限公司提供；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自美國NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司；抗生素殺稻瘟菌素S購自美國Invitrogen公司；GHSR1a和GAPHD的上、下游引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；聚凝胺購自Sigma公司；HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG及ABC免疫組化檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；化學發(fā)光試劑和Ki-67鼠抗人單克隆抗體購自碧云天生物技術研究所； TUNEL試劑盒購自深圳晶美生物技術有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)和實驗動物 人胚腎細胞株HEK-293T、人直腸癌低分化腺癌細胞株SW480購自美國標準生物品收藏中心（American type culture collection， ATCC），所有細胞均培育于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和1%谷氨酸鹽，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當細胞融合成80%～90%時以胰蛋白酶消化并傳代，取對數(shù)生長期細胞為實驗對象。24只4～5周齡雌性BALB/c-nu/nu品系裸鼠購自北京維通利華公司，體重（18.4±0.7）g，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)于湘雅醫(yī)學院動物實驗中心無特定病原體級實驗室。

1.3設計干擾序列及陰性對照序列 針對已經(jīng)公布的GHSR1a基因序列（NM 198407），設計針對人GHSR1a基因的干擾 RNA 序列（GHSR1a shRNA），正義鏈序列為：5′-TGAGAAAGCTCTCCACTCTGTTCAAGAGACAGAGTGGAGAGCTT TCTCTTTTTTC-3′，反義鏈序列：5′-ACTCTTTCGAGAGGTGAGACAAGTTCTCTGTCTCACCTCTCGAAAGAGAAAAAAGA GCT-3′。同時設計 1 條陰性對照序列（NC shRNA），正義鏈序列為：5′-TAACTAGTAACGGCTGCTCCTTCAAGAGAGGAG CAGCCGTTACTAGTTTTTTTTC-3′，反義鏈序列：5′-ATTGATCATTGCCGACGAGGAAGTTCTCTCCTCGTCGGCAAT GATCAAAAAAAAGAGCT-3′，并通過BLAST檢索驗證該序列不對任何基因起干擾效應。所有shRNA由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.4構建和鑒定慢病毒表達載體 在干擾RNA序列正義鏈及反義鏈的5′端分別加上Age Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位點，應用限制性內(nèi)切酶Age I和EcoR I雙酶切空載體PLLU2G與稀釋和退火（退火反應條件：95℃ 10 min，75℃ 10 min，55℃ 10 min，35℃ 10 min，15℃ 10 min）后的GHSR1a shRNA及NC shRNA在T4 DNA連接酶作用下進行連接反應，轉染新鮮大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α并挑選陽性重組克隆，經(jīng)北京華大基因研究中心測序檢測證實與目的基因GHSR1a cDNA序列一致。

1.5慢病毒重組體的包裝 取對數(shù)生長期的HEK-293T細胞，將5×106個細胞接種于培養(yǎng)皿中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液，加入5 ml Opti-MEM培養(yǎng)液。在一支離心管中加入20 μg重組干擾質(zhì)粒pLenR-GPH（表達綠色熒光蛋白）或20 μg陰性對照質(zhì)粒，分別加入Opti-MEM培養(yǎng)液中并混勻，調(diào)整溶液體積為2.5 ml。在另一支離心管中加入100 μL Lipofectamine 2000，加入2.4 ml Opti-MEM 培養(yǎng)液混勻，將上述質(zhì)粒溶液和Lipofectamine 2000稀釋液混合并制備成質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物，置室溫20 min。將3 mL質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物轉移至HEK-293T細胞的培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 h，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心并過濾后分裝，使用逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度后保存于-80℃環(huán)境下。將對數(shù)生長期的SW480細胞接種入6孔板中，培養(yǎng)24 h后每孔加入shRNA 慢病毒濃縮液進行感染。感染72 h在后熒光顯微鏡下觀察 GFP 表達情況，感染效率大于80%后進行后續(xù)實驗。將感染后的細胞分成兩份，一份用于提取RNA進行RT- PCR實驗，應用2-ΔΔCT法計算原始CT值，另一份使用western blot法檢測細胞中GHSR1a蛋白表達。

1.6 制備裸鼠直腸癌SW480細胞皮下移植瘤模型及分組。取對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和感染組SW480細胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整密度為5×106個/ml，裸鼠皮膚消毒后，將100 uL上述細胞懸液注射至裸鼠左腋窩皮下，每組8只，接種腫瘤后裸鼠置于（Specefic pathogen Free， SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)。注射腫瘤細胞后第40 d時處死裸鼠，剝離裸鼠皮下腫瘤標本后稱重。

1.7免疫組織化學法（IHC）檢測皮下移植瘤組織中Ki-67的表達 所有標本經(jīng)4%中性甲醛固定、石蠟包埋、5 um切片后脫蠟至水，按照ABC免疫組化檢測試劑盒操作說明進行操作，采用免疫組織化學SABC法。高溫高壓5 min抗原修復后阻斷內(nèi)源性過氧化酶在室溫下孵育 10分鐘，Ki-67稀釋比例為1：100，陰性對照以PBS代替一抗，表達陰性。Ki-67表達結果判定參考Kunnumakkara[6]等的方法，Ki-67染色陽性細胞為細胞核為棕褐色，其余部位不著色，，在低倍鏡（×100）下隨機選擇20個視野（每個視野計數(shù)200個細胞），計數(shù)染色陽性細胞所占比例。

1.8 TUNEL法檢測皮下移植瘤細胞凋亡 每組標本按TUNEL試劑盒說明書操作，移植瘤標本經(jīng)甲醛固定，制成蠟塊后4 μm厚度切片，進行TUNEL染色。TUNEL染色陽性細胞判定標準為胞漿不著色，胞核染成棕褐色，核固縮，染色質(zhì)凝集成塊或邊集者，隨機選擇20個視野（×100），每個視野計數(shù)200個細胞，計數(shù)5個視野，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.9數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理 各項實驗均重復3次，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，總體及總體中兩樣本均數(shù)之間比較采用ANOVA方差SNK-q法分析，以P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1建立穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的直腸癌細胞株SW480。經(jīng)重組慢病毒感染SW480細胞后，即獲穩(wěn)定低表達GHSR1a的SW480細胞，見圖1A，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，見圖1B，經(jīng)sorting流式細胞儀檢測，感染效率為98.8%，見圖1C，表明成功建立穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的SW480細胞株。沉默GHSR1a基因的SW480細胞的GHSR1a mRNA表達較BC組和NC組明顯下調(diào)，見圖2，GHSR1a mRNA的抑制率達71.5%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

圖1 在光學顯微鏡（A）和熒光顯微鏡（B）下觀察穩(wěn)定低表達GHSR1a的直腸癌SW480細胞；C：流式細胞術分析轉染效率。

圖2 RT-PCR檢測直腸癌SW480細胞中GHSR1a mRNA水平表達，以GAPHD為內(nèi)參。

2.2沉默GHSR1a基因表達抑制裸鼠直腸癌皮下移植瘤生長。腫瘤細胞接種裸鼠皮下15 d后即可在皮下觸及腫瘤，成瘤率為100%，飼養(yǎng)至第40 d實驗結束時，實驗動物均未出現(xiàn)死亡。實驗結束后剝離裸鼠皮下移植瘤組織后稱重，BC組、NC組和KD組腫瘤平均重量分別為（1.22±0.34）g、（1.09±0.28）g和（0.63±0.17）g，KD組裸鼠腫瘤重量明顯低于BC組或NC組，有顯著性差異（F=6.683，P=0.011），而BC組與NC組相比較，無統(tǒng)計學顯著性（P=0.458）。

2.3感染GHSR1a shRNA抑制皮下移植瘤細胞中Ki-67表達及誘導細胞凋亡 免疫組化染色結果表明，Ki-67染色陽性細胞表現(xiàn)為僅胞核染成棕褐色，BC組和NC組中Ki-67陽性細胞所占比例分別為（89.4±7.5）%和（85.7±6.3）%，而KD組腫瘤細胞中Ki-67陽性細胞比例[（47.2±3.7）%]明顯低于BC組和NC組，差異有統(tǒng)計學意義（方差分析，F(xiàn)=76.088，P<0.001），見圖3A；TUNEL檢測結果表明，各組均可見凋亡細胞，BC組和NC組細胞凋亡指數(shù)分別為（3.2±0.8）%和（4.4±0.7）%，而KD組細胞凋亡指數(shù)明顯高出前兩者，為（8.7±1.4）%，差異有統(tǒng)計學意義（方差分析，F(xiàn)=44.486，P<0.001），見圖3B。

圖3 免疫組化檢測各組裸鼠直腸癌皮下移植瘤細胞中Ki-67的表達（A）；B：TUNEL法檢測各組皮下移植瘤細胞凋亡（×400）。

3 討論

研究表明ghrelin及其受體GHSR在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，同時與腫瘤細胞的多種惡性生物學行為密切相關[4-6]，GHSR1a作為GHSR的亞型之一在調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞生長過程中發(fā)揮了一定作用[7-8]，表明GHSR1a可能與惡性腫瘤細胞增殖相關，但GHSR1a在人結直腸癌中的表達及其對腫瘤增殖和凋亡作用機制尚未見報道。在前期研究中，我們通過建立穩(wěn)定感染GHSR1a shRNA的直腸癌SW480細胞，在體外實驗中，沉默GHSR1a對直腸癌細胞增殖有明顯抑制作用，并誘導細胞凋亡，為進一步明顯這種增殖抑制作用在體內(nèi)實驗中是否依然有效。為此，本研究通過建議裸鼠直腸癌皮下移植瘤模型，并觀察沉默GHSR1a對體內(nèi)直腸癌生長及凋亡的影響，結果表明抑制GHSR1a在直腸癌細胞中的表達可明顯抑制體內(nèi)直腸癌生長，并誘導細胞凋亡。

RNA干擾技術是一種通過雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘導特異性序列基因沉默的過程，當前RNA干擾技術已成為當前研究基因功能的重要工具[7]。小片段干擾RNA（small interfering RNA， siRNA）存在轉染效率低、半衰期短、維持時間較短等缺點，近年來發(fā)展的慢病毒介導的shRNA技術通過整合到宿主細胞的基因組實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達，可高效抑制靶基因表達，成為基因沉默的最常用選擇[9]。在本研究中，筆者通過RNA干擾技術設計了特異性靶向GHSR1a基因的shRNA，并通過慢病毒的介導感染至人直腸癌SW480細胞，從而首次獲得穩(wěn)定沉默GHSR1a基因表達的直腸癌細胞株，結果表明，感染GHSR1a shRNA慢病毒表達載體后可明顯下調(diào)GHSR1a mRNA在SW480細胞中的表達。癌癥的發(fā)生是多基因和多因素共同參與的細胞增殖、分化以及凋亡異常的過程，而腫瘤細胞凋亡異常與惡性腫瘤的關系最為密切。在本研究中，筆者建立裸鼠直腸癌皮下移植瘤模型。體內(nèi)實驗結果首次表明GHSR1a shRNA可抑制增殖因子Ki-67在皮下移植瘤組織中的表達，另外TUNEL實驗結果表明感染組中直腸癌凋亡細胞明顯增加，從而抑制裸鼠皮下移植瘤生長，表明GHSR1a在調(diào)控直腸癌細胞増殖和凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。而GHSR1a有望成為新的直腸癌治療的作用靶點。當前，已有GHSR拮抗劑和反向激動劑安全地用于人體實驗和嚙齒動物中，并取得了良好的療效[10- 11]。

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編輯/張燕