HEV ORF2 P179重組蛋白特異性單克隆抗體的制備和鑒定

摘要：目的 制備戊型肝炎病毒ORF2 P179重組蛋白特異性單克隆抗體并分析其生物學(xué)特性。方法 利用重組純化的戊型肝炎病毒HEV ORF2 P179蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合、采用間接ELISA方法篩選鑒定高效穩(wěn)定分泌HEV ORF2 P179特異性單克隆抗體的融合細(xì)胞。結(jié)果 兩株株雜交瘤細(xì)胞A3和F5可以分泌特異性的針對(duì)HEV ORF2 P179蛋白的單克隆抗體。結(jié)論 獲得HEV ORF2 P179特異性單克隆抗體，為戊型肝炎診斷試劑開(kāi)發(fā)和基因工程疫苗研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：戊型肝炎病毒；ORF2 P179重組蛋白；單克隆抗體（McAb）

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV），為單股正鏈RNA病毒，是急性戊型肝炎的致病病原體。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)高效抗HEV病毒藥物，戊型肝炎是當(dāng)今發(fā)展中國(guó)家的主要肝炎之一，在我國(guó)，近年來(lái)戊型肝炎發(fā)病人數(shù)逐年上升嚴(yán)重危害人類健康，研發(fā)針對(duì)HEV的診斷和治療試劑刻不容緩[1-3]。

1 資料與方法

1.1一般資料 HEV ORF2 P179蛋白[4]及SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由東南大學(xué)孟繼鴻教授提供；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、HAT、HT、1640選擇培養(yǎng)基、HRP-羊抗鼠IgG購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；PEG（MW，4000）購(gòu)自sigma公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BALB/c小鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2方法

1.2.1 BALB/c小鼠免疫 使用生理鹽水將HEV ORF2 P179重組蛋白稀釋至終濃度為0.2 mg/ml，與弗氏完全佐劑等體積混合、反復(fù)吹打使蛋白充分乳化。經(jīng)腹部皮下多點(diǎn)注射于6～8周齡的雌性BALB/c小鼠4只，每只小鼠接種40 μg HEV ORF2 P179重組蛋白進(jìn)行免疫。第2 w使用不完全佐劑乳化HEV ORF2 P179蛋白，每只小鼠接種40 μg 重組蛋白進(jìn)行免疫。第4 w注射相同劑量不加佐劑的HEV ORF2 P179重組蛋白進(jìn)行免疫。每次免疫前1 d取小鼠尾靜脈血，取血后置于37℃ 1 h，然后置于4℃過(guò)夜，1000 rpm離心后取上清液備檢測(cè)。通過(guò)間接ELISA檢測(cè)上述方法處理血清中HEV ORF2 P179抗體效價(jià)。對(duì)抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫，使用加倍劑量不加佐劑的蛋白腹腔注射，3 d后殺死小鼠取脾細(xì)胞。

1.2.2 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng) SP2/0細(xì)胞置于25 cm2康寧培養(yǎng)瓶中，使用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃，5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞狀態(tài)完好、邊界清晰，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上進(jìn)行分瓶傳代。

1.2.3飼養(yǎng)細(xì)胞制備 細(xì)胞融合前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞：取6～8周齡小鼠斷頸處死，用清水沖洗，于75%乙醇中浸泡5～10 min，超凈臺(tái)中無(wú)菌操作下腹剪一小口，用5～10 ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗腹腔3～5次，收集沖洗液于離心管進(jìn)行離心棄去上清，清洗細(xì)胞沉淀2～3次（800 rpm，5 min），清洗結(jié)束后加入含有HAT的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于96孔板，每孔100 μl，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4間接ELISA測(cè)定免疫小鼠抗體效價(jià) 選用100 μl（1 ng/μl）HEV ORF2 P179蛋白包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，然后用PBST清洗3次，洗去未結(jié)合蛋白，再用1%BSA 37℃封閉1 h，再用PBST清洗3次，洗去未結(jié)合蛋白。將免疫過(guò)的小鼠血清及未免疫的小鼠血清分別進(jìn)行倍比稀釋，每孔加100 μl，37℃孵育1 h，PBST清洗3次，再加稀釋3000倍的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG每孔100 μl，37℃孵育1 h，再加TMB顯色液每孔50 μl顯色30 min，再用含硫酸的終止液每孔50 μl終止。最后進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)得小鼠血清中HEV ORF2 P179抗體效價(jià)。

1.2.5細(xì)胞融合 取沖擊免疫3 d后小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在45% PEG（MW，4000）作用下按5～10∶1的比例融合，使用添加HAT的20%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)，2 w后改用添加HT的20%胎牛血清的1640繼續(xù)培養(yǎng)兩周，最后換成含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，取上清液，使用ELISA方法檢測(cè)上清液中抗體的效價(jià)。選取效價(jià)高的陽(yáng)性孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，建立有效分泌HEV ORF2 P179單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.6小鼠腹水的制備及western blot分析檢測(cè) 取6～8 w齡小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5 ml，經(jīng)1 w弗氏不完全佐劑預(yù)處理后，再給小鼠腹腔注射分泌HEV ORF2 p179單抗的雜交瘤細(xì)胞，約1 w后得小鼠腹腔隆起產(chǎn)生腹水。反復(fù)抽取收集腹水約5 ml，1000 rpm，8 min離心棄去沉淀，收集上清。先將HEV ORF2 p179經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳，再將蛋白電轉(zhuǎn)移（100 V，60 min）至PVDF膜，然后BSA封閉PVDF膜1 h，后用TBST清洗3次，5 min/次，加入一抗（小鼠腹水上清）37℃孵育1 h。再用TBST清洗3次，10 min/次，加入二抗（羊抗鼠IgG，1∶1000 TBS稀釋）37℃孵育1 h，TBST清洗未結(jié)合的蛋白，最后用DAB顯色液顯色。

2 結(jié)果

2.1 HEV ORF2 p179經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果 將重組表達(dá)的HEV ORF2 p179蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析在48 kDa出現(xiàn)單一區(qū)帶，且與預(yù)期大小一致。

圖1 HEV ORF2 p179蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳圖

注：Lane 1：protein marker；lane 2：ORF179 protein.

2.2不同組小鼠免疫血清檢測(cè)效價(jià) 經(jīng)過(guò)免疫的BALB/c小鼠和未經(jīng)免疫的對(duì)照組小鼠的不同時(shí)間點(diǎn)血清，經(jīng)ELISA分析OD值有明差別，且HEV ORF2 p179免疫組小鼠抗體效價(jià)的2，4，6 w有明顯增高，見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組和對(duì)照組小鼠血清血清中

P179抗體間接ELISA分析

2.3腹水型單克隆抗體western blot分析 弗氏不完全佐劑預(yù)處理并注射ELISA鑒定陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞的小鼠收集其腹水，對(duì)其上清液使用HEV ORF2 p179作為抗原進(jìn)行western blot分析，出現(xiàn)陽(yáng)性DAB顯色條帶。證明腹水上清液中存在針對(duì)于HEV ORF2 p179的抗體蛋白。

圖3 HEV ORF2 p179的抗體蛋白

注：Lane 1 and lane 2：western blotting with HEV ORF2 p179 specific antibody.

3 討論

戊型肝炎病毒（HEV）為單股正鏈RNA，自1955年印度水源污染發(fā)生了第一次戊型肝炎大暴發(fā)以來(lái)，先后在印度、尼泊爾、蘇丹、及我國(guó)新疆等地有數(shù)次爆發(fā)流行。戊型肝炎患者多為輕中型肝炎，兒童感染則表現(xiàn)亞臨床型較多，孕婦患戊型肝炎病情嚴(yán)重，在妊娠的后3個(gè)月發(fā)生感染病死率達(dá)20%。成人病死率高于甲型肝炎[5-7]。根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》，戊型肝炎病毒引起的病毒性肝炎疾病屬于乙類傳染病。研發(fā)針對(duì)戊型肝炎病毒（HEV）的診斷和治療試劑刻不容緩。

HEV感染后可產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，防止同株甚至不同株HEV再感染。有人報(bào)告絕大部分患者康復(fù)后血清中抗HEV抗體持續(xù)存在4～14年。天然的HEV來(lái)源有限，重組HEV蛋白做未免疫原同樣可以獲得有中和保護(hù)作用的抗體。HEV ORF2編碼衣殼蛋白C端的439aa到617aa的這一段氨基酸序列的是一組中和抗原表位的最短多肽，HEV ORF2 P179 重組蛋白可以作為有效的潛在戊肝疫苗[8-10]。

本研究以HEV ORF2 P179 重組蛋白為免疫原對(duì)BALB/c小鼠腹腔皮下注射法實(shí)施多點(diǎn)注射免疫，通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)制備HEV ORF2 P179的單克隆抗體并分析其生物學(xué)特性。通過(guò)間接ELISA分析，確定小鼠免疫后第6 w可以在血清中檢測(cè)到針對(duì)HEV ORF2 P179的陽(yáng)性中和抗體，并且對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)兩株高效穩(wěn)定分泌特異性抗體的細(xì)胞。對(duì)HEV ORF2 P179抗體陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆，建立有效分泌HEV ORF2 P179單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。并通過(guò)制備小鼠腹水型單抗再次確認(rèn)雜交瘤細(xì)胞中可以分泌HEV ORF2 P179的單克隆抗體。針對(duì)HEV ORF2 P179單克隆抗體的研發(fā)，可以為戊型肝炎診斷試劑和戊型肝炎基因工程疫苗的研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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編輯/肖慧