EGCG與臨床常用三聯(lián)療法對胞內(nèi)幽門螺桿菌的抗菌活性研究

摘要：目的 探究EGCG與臨床常用三聯(lián)療法對胞內(nèi)幽門螺桿菌的抗菌活性進一步探究EGCG對臨床常用療法抗胞內(nèi)幽門螺桿菌的活性的影響。方法 利用AGS細胞建立幽門螺桿菌胞內(nèi)感染模型，胞內(nèi)活菌計數(shù)法測定胞內(nèi)幽門螺桿菌數(shù)量。結(jié)果 EGCG具有較強的胞內(nèi)抗菌活性，臨床常用抗Hp療法不能有效清除胞內(nèi)幽門螺桿菌，EGCG在其4～64 mg/L濃度范圍內(nèi)，能夠明顯增強臨床常用抗Hp療法的胞內(nèi)抗菌作用。結(jié)論 蘭索拉唑+阿莫西林+莫西沙星具有較強的抗胞內(nèi)幽門螺桿菌能力，EGCG能夠在一定程度上增強臨床常用療法的抗胞內(nèi)幽門螺桿菌能力，有望用于治療胞內(nèi)幽門螺桿菌感染。

關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌；AGS細胞；胞內(nèi)抗菌活性；EGCG；莫西沙星

Abstract：Objective To explore the antibacterial activities of EGCG and the regular therapies and the influence of EGCG on the regular therapies against intracellular Helicobacter pylori.Methods Intracellular infection model of standard Helicobacter pylori was established using AGS cell.The viable count method was used to determine the intracellular Helicobacter pylori after cell rupture.Results EGCG demonstrates antibacterial activity against the intracellular Helicobacter pylori and the regular therapies cannot eliminate the intracellular Helicobacter pylori EGCG obviously increased the activities of the regular therapies against intracellular Helicobacter pylori within 4～64mg/L. Conclusion The MXF-LAN-AMX combination demonstrates a greate ability EGCG can enhance the activities of the three regular therapies against intracellular Helicobacter pylori and may be used to treat the clinical infection of intracellular Helicobacter pylori.

Key words：Helicobacter pylori；Intracellular antibacterial activities；AGS；EGCG；Moxifloxacin

幽門螺桿菌（Hp）是引起胃炎、胃潰瘍和胃癌等疾病的主要致病因子。最近研究發(fā)現(xiàn)它也具有侵入細胞內(nèi)的特點[1]，這使得抗生素對它的殺菌作用增加了難度[2]。目前，臨床治療Hp感染的常用療法有質(zhì)子泵抑制劑（PPI）+阿莫西林+克拉霉素、PPI+阿莫西林+左氧氟沙星、PPI+阿莫西林+莫西沙星。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作為兒茶素的主要活性成分，對胞外幽門螺桿菌具有抗菌活性，且能夠增強阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素對胞外幽門螺桿菌的殺滅作用[3]。此外，EGCG能夠增強細胞的自噬功能，從而提高細胞對胞內(nèi)菌如嗜肺軍團菌、結(jié)核分枝桿菌的清除能力，但它對胞內(nèi)的幽門螺桿菌是否有活性，目前還沒有報道。本實驗旨在探究EGCG與臨床常用抗幽門螺桿菌三聯(lián)療法的胞內(nèi)抗菌活性，為臨床治療幽門螺桿菌感染提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料 幽門螺桿菌ATCC 43504，胃腺癌上皮細胞（AGS）ATCCC RL-1739。2二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；微需氧產(chǎn)氣袋、厭氧罐（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社）；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、克拉霉素（CLA）、阿莫西林（AMX）、莫西沙星（MXF）、蘭索拉唑（LAN）（南京森貝伽生物科技有限公司），左氧氟沙星（LVX）（揚子江藥業(yè)有限公司），硫酸慶大霉素（Biosharp），幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基、幽門螺桿菌添加劑（青島海博生物技術(shù)有限公司），哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），胎牛血清（Biological Industries），新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），F(xiàn)-12k細胞培養(yǎng)基（Gibco）。

1.2方法

1.2.1 Hp細胞內(nèi)感染模型的構(gòu)建 按照文獻[2]方法，構(gòu)建Hp胞內(nèi)感染模型，計算Hp的侵襲率，侵襲率=胞內(nèi)細菌數(shù)/感染細胞的細菌數(shù)×100%，當(dāng)侵襲率高于0.1%時，說明模型構(gòu)建成功。

1.2.2藥物對胞內(nèi)Hp的抗菌活性測定 將含不同濃度的上述藥物（1 mg/L～512 mg/L）的F-12k細胞培養(yǎng)基與受感染的細胞共培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。最后棄掉含藥培養(yǎng)基，用F-12k細胞培養(yǎng)基沖洗細胞6次，加入0.5 mL無菌蒸餾水溶解細胞，用菌落計數(shù)法檢測胞內(nèi)細菌數(shù)。

1.2.3細胞內(nèi)時間殺菌曲線測定 用含上述藥物的F-12k細胞培養(yǎng)基替換原感染細胞培養(yǎng)基，37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、4、12、24 h取樣，棄掉含藥培養(yǎng)基，用F-12k沖洗細胞6次，加入0.5 mL無菌蒸餾水溶解細胞，采用菌落計數(shù)法檢測細菌數(shù)

1.2.4 EGCG與臨床常用抗Hp療法聯(lián)用時對胞內(nèi)Hp的抗菌作用測定 按照1.2.3的方法，測定不同濃度EGCG與臨床常用抗Hp療法聯(lián)用時胞內(nèi)Hp的數(shù)量

1.2.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism5和SPSS 19.0處理實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較對照組和藥物處理組的不同，P<0.05具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1藥物對胞內(nèi)Hp的抗菌活性測定結(jié)果 4種抗生素的胞內(nèi)抗菌活性測定結(jié)果見表1。其中，AMX沒有顯示出胞內(nèi)抗菌活性，CLA、LVX、MXF顯示較弱的胞內(nèi)抗菌活性，活性大小依次增加，但是均高于它們在臨床使用劑量下的平均血藥濃度。而EGCG具有較強的胞內(nèi)抗菌活性。

2.2臨床常用三聯(lián)療法對胞內(nèi)Hp的抗菌作用 臨床常用三聯(lián)抑制Hp的胞內(nèi)外時間殺菌曲線，在胞內(nèi)條件下，LAN+AMX+MXF組具有較強的抗菌作用，LAN+AMX+LVX組具有較弱的抗菌作用，LAN+AMX+CLA組沒有明顯的殺菌作用。

2.3 EGCG對臨床常用三聯(lián)療法抗胞內(nèi)Hp活性的影響實驗結(jié)果 EGCG與臨床常用三聯(lián)療法聯(lián)用后，AGS胞內(nèi)Hp的活菌數(shù)量測定，當(dāng)EGCG與LAN+AMX+MXF聯(lián)用時，顯示出了最強的抗菌活性；其次為EGCG與LAN+AMX+LVX聯(lián)用組；EGCG與LAN+AMX+CLA組顯示出了較弱的胞內(nèi)抗菌活性

3討論

幽門螺桿菌的胞內(nèi)入侵，給臨床根除Hp治療帶來了很大障礙。本實驗證明，EGCG具有明顯的胞內(nèi)抗菌活性，這可能與它增強細胞的自噬功能有關(guān)。臨床抗Hp聯(lián)用療法中PPI+AMX+MXF具有明顯的胞內(nèi)抗菌活性，這為優(yōu)化臨床療法，提供一定的理論依據(jù)。此外EGCG能夠明顯增強臨床常用抗Hp療法的胞內(nèi)抗菌作用，有望用于輔助治療。

參考文獻：

[1]Bjrkholm B，Zhukhovitsky V，Lfman C，et al.Helicobacter pylori Entry into Human Gastric Epithelial Cells：A Potential Determinant of Virulence，Persistence，and Treatment Failures 1[J].Helicobacter，2000，5（3）：148-154.

[2]Lai C H，Kuo C H，Chen P Y，et al.Association of antibiotic resistance and higher internalization activity in resistant Helicobacter pylori isolates[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2006，57（3）：466-471.

[3]Yanagawa Y，Yamamoto Y，Hara Y，et al.A combination effect of epigallocatechin gallate，a major compound of green tea catechins，with antibiotics on Helicobacter pylori growth in vitro[J].Current microbiology，2003，47（3）：0244-0249.編輯/丁一