淺析免疫組化技術(shù)

免疫組織化學(xué)簡稱免疫組化，又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)，免疫組化技術(shù)近年來得到迅速發(fā)展。病理診斷如果應(yīng)用的是免疫熒光法，則必須要具備熒光顯微鏡，而熒光的強(qiáng)會因?yàn)闀r間的增長而慢慢消退，要長期保存結(jié)果非常難。也正是因?yàn)槿绱耍茝V應(yīng)用受到了較大的限制。免疫酶法逐漸將其取代。在已知的抗原分子或者是抗體上標(biāo)記熒光素。如果相應(yīng)的抗體或者是抗原發(fā)生反應(yīng)，那么由此而產(chǎn)生的復(fù)合物上就會有熒光素的存在。使用熒光顯微鏡可以很容易看見熒光和抗原體相結(jié)合的部位，將抗體或者是抗原測出。

1 免疫熒光法

按照抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合步聚，免疫熒光法可分以下3種。

1.1直接法 用熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)的抗原結(jié)合，以檢查出相應(yīng)的抗原成分。

1.2間接法 先用特異性抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗體，再用熒光素標(biāo)記的抗特異性抗體（間接熒光抗體）與特異性抗體相結(jié)合，形成抗原一特異性抗體一間接熒光抗體的復(fù)合物。

1.3補(bǔ)體法 用具有特異性的的補(bǔ)體以及抗體的混合液使其與標(biāo)本上的抗原產(chǎn)生反應(yīng)。補(bǔ)體會出現(xiàn)在原抗體的復(fù)合物上，再使用抗補(bǔ)體中的熒光抗體與其進(jìn)行結(jié)合，獲得\"抗原一抗體一補(bǔ)體一抗補(bǔ)體熒光抗體\"的復(fù)合物。

優(yōu)點(diǎn)：酶反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)的顏色能在一般的普通生物顯微鏡下觀察，其產(chǎn)物因具有一定電子密度也可在電鏡下觀察.標(biāo)本能長期保存并能加HE染色等其他復(fù)染，有利于將被檢測物質(zhì)與病變的形態(tài)學(xué)改變聯(lián)系起來（定性與定位）酶的選擇；從理論的角度來說講，采用細(xì)胞化學(xué)的方法能夠被顯出出來的酶，幾乎都可以用來標(biāo)記抗體實(shí)現(xiàn)免疫酶法染色，而在實(shí)際的應(yīng)用當(dāng)中，可以被用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的酶沒有很多。

可用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備：酶催化的底物必需是特異的，而且容易 被顯示反應(yīng)的終產(chǎn)物所形成的沉淀必須穩(wěn)定即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，而影響組織學(xué)定位，較易獲得純的酶分子中性PH值時，酶分子應(yīng)穩(wěn)定在酶標(biāo)過程中，酶連接在抗體上，不能影響二者的活性檢組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似的物質(zhì)，否則結(jié)果將難以判定符合上述要求的。最為常用的酶是辣根過氧化物酶其次是堿性磷酸酶，除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶等，但因其形成的不溶性色素?cái)U(kuò)散作用較大，在應(yīng)用上受到很大限制。

2 免疫組織化學(xué)方法

是一種把分子水平的物質(zhì)準(zhǔn)確具體表達(dá)出來的一種方法，在常規(guī)病理診斷中，可借助于免疫組化來輔助診斷，歸納起來，有以下8個方面。

2.1腫瘤的組織起源方面進(jìn)行鑒別診斷 免疫組織化學(xué)在確定組織起源中的應(yīng)用是無限的。免疫組化技術(shù)是一個復(fù)雜的生物技術(shù)，對每一個抗體標(biāo)記物都有獨(dú)自特定的染色方法，目的是能夠明確各種組織起源，判定組織中是否存在特異抗原。

2.2發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，腫瘤生長活躍程度的綜合判斷。激素受體的檢測以指導(dǎo)臨床治療乳腺癌ER、PR的檢測。乳腺癌細(xì)胞中雌激素表達(dá)陽性，患者可以進(jìn)行三苯氧胺的治療，雌激素能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長，三苯氧胺有封閉癌細(xì)胞中雌激素受體的功能，免疫組織化學(xué)測定雌激素受體的表達(dá)情況，可以預(yù)測三苯氧胺治療的意義。

2.3雌激素陰性赫賽汀治療。

2.4胃腸道間質(zhì)瘤用格列衛(wèi)治療胃腸道間質(zhì)瘤CD117的。

2.5檢測激素類細(xì)胞的定位和定性以進(jìn)一步明確內(nèi)分泌細(xì)胞的類型和功能狀態(tài)，如垂體瘤、胰島細(xì)胞瘤、類癌等。

2.6指導(dǎo)腫瘤分期 通過免疫組化清楚顯示腫瘤對基底膜、血管的浸潤，從而獲得準(zhǔn)確的分期。指導(dǎo)腫瘤預(yù)后的判斷如目前開展的癌基因的免疫組化檢測，瘤細(xì)胞抗藥性的檢測等免疫性疾病的輔助診斷如腎小球腎炎、某些皮膚疾病等對組織內(nèi)免疫球蛋白、補(bǔ)體、免疫復(fù)合物的檢測。

2.7免疫組化標(biāo)記具有形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的正確判斷。

2.8根據(jù)陽性標(biāo)記的顯色程度分為：淡黃色，提示弱陽性；棕黃色，為中等強(qiáng)度；棕黑色，示為強(qiáng)陽性。在結(jié)果判斷中，后兩者較有意義，可作為判讀依據(jù)。而前者除考慮標(biāo)本處理和方法學(xué)因素外，可能與細(xì)胞只有輕度異常表達(dá)，或某些細(xì)胞攝取了周圍組織抗原之故。

在標(biāo)記免疫組化中，陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征是要將抗原在細(xì)胞里的分布以及定位情況反映出來。擬標(biāo)記的細(xì)胞是診斷中陽性細(xì)胞的前提。陽性表達(dá)的實(shí)現(xiàn)要在細(xì)胞某個特定的抗原地方。否則不能把陽性當(dāng)作主要的判斷依據(jù)。

3 類型

根據(jù)抗原在細(xì)胞中分布和陽性顆粒沉淀部位可分為以下5種類型。

3.1胞膜型 陽性顆粒主要分布于細(xì)胞膜表面，形成一薄層棕黃色顆粒包繞整個細(xì)胞。此類型常見于某些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白細(xì)胞共同抗原（LCA）及B細(xì)胞、T細(xì)胞、C-erbB2等。

3.2胞核型 陽性顆粒定位于細(xì)胞核，呈均勻分布或位于核膜下，有的呈小斑塊狀不規(guī)則分布。此多見于增殖細(xì)胞核抗原（PCNA、Ki-67）及激素受體中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和基因P53等。

3.3胞漿型 陽性顆粒主要分布于細(xì)胞漿。大部分抗原均屬于此種類型，如細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、結(jié)蛋白、神經(jīng)絲蛋白、肌紅蛋白及前列腺特異性抗原（PSA）等。

3.4微絨毛型 抗原顆粒主要分布于腺癌細(xì)胞的微絨毛，而胞漿和胞膜可以是陽性或陰性表達(dá)。這種表現(xiàn)形式最常見于各種腺癌，如甲狀腺腺癌、乳腺腺癌等。其特點(diǎn)是陽性顆粒除靠近腔面陽性外，其余基底部可呈陰性反應(yīng)。在腫瘤標(biāo)記物中多見于上皮膜抗原、結(jié)腸相關(guān)抗原等。甲狀腺腺癌中甲狀腺球蛋白常以該形式出現(xiàn)。

3.5復(fù)合型 在常規(guī)免疫組化標(biāo)記中，同一種抗原可同時表達(dá)于胞膜和胞漿、胞核和胞漿、微絨毛和胞漿、但很少發(fā)現(xiàn)胞膜和胞核同時表達(dá)。以下情況可干擾免疫組化標(biāo)記結(jié)果的觀察和判斷：①抗體交叉反應(yīng)；②腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)；③腫瘤細(xì)胞吞噬組織抗原。

4 免疫組化結(jié)果的判讀原則及對假陰性和假陽性的認(rèn)識

免疫組化具有特異性強(qiáng)、敏感性高及定位正確等優(yōu)點(diǎn)，因此，掌握對免疫組化結(jié)果的判讀原則是很重要的。

4.1必須設(shè)染色對照 每批染色都要以特異性的陽性對照和陰性對照為基礎(chǔ)，才能對染色結(jié)果做出正確的判讀。沒有陽性對照，就不能做出真正陰性結(jié)果的判斷；同理，沒有陰性對照，也就不能做出真正陽性結(jié)果的判斷。因而，沒有對照的免疫組化染色，即使做出了判斷也是不可信的。

4.2抗原表達(dá)必須在特定部位 陽性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性，如LCA在細(xì)胞膜上，不在抗原所在部位的陽性表達(dá)一概不能視為陽性。

4.3陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá) 即陰性結(jié)果不能認(rèn)為具有否定意義：陽性表達(dá)有強(qiáng)弱、多少之分，即使是只有少數(shù)細(xì)胞陽性（但要在抗原所在部位）也要視為陽性表達(dá)，不能認(rèn)為個別細(xì)胞陽性而不作陽性看待。

4.4免疫組化與HE切片診斷應(yīng)以HE切片診斷為準(zhǔn) 當(dāng)免疫組化診斷結(jié)果與HE切片診斷不一致時，應(yīng)再結(jié)合臨床資料、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果綜合分析，不能用免疫組化檢查結(jié)果推翻HE切片診斷。

4.5假陰性結(jié)果的原因 ①抗體已失活或濃度不當(dāng)或抗體本身達(dá)不到應(yīng)有的敏感度；②由于組織自溶，抗原擴(kuò)散而導(dǎo)致抗原消失，特別在長期固定的標(biāo)本中因抗原漏出而導(dǎo)致假陰性，因此應(yīng)多用新鮮固定的標(biāo)本；③操作步驟不當(dāng)，如反應(yīng)時間不夠或過久、洗脫不夠或溫度過高；④組織或細(xì)胞中抗原的含量很低，所用的方法難以檢測到，如用直接法檢測為陰性，但改用間接法時則為陽性。

4.6假陽性結(jié)果的主要原因 ①所用的抗體與其它無關(guān)的抗原有交叉反應(yīng)，特異性差，特別在應(yīng)用多克隆抗血清時更易出現(xiàn)；②所用抗體濃度過高或染色過程中切片干燥導(dǎo)致抗體與組織產(chǎn)生非特異性結(jié)合；③組織或細(xì)胞中內(nèi)源性過氧物酶、堿性磷酸酶及生物素等產(chǎn)生非特異性顯色操作中。

5 注意事項(xiàng)

免疫組化過程中應(yīng)注意以下問題。

5.1均勻的背景染色 ①酶-底物反應(yīng)時間過長；②在孵育中切片干燥；③一抗或二抗稀釋度不夠；④切片洗滌不充分；⑤封閉所用的正常血清不對二。

5.2部分區(qū)域背景著色 ①切片部分區(qū)域干燥；②顯色反應(yīng)物在封片介質(zhì)中是可溶的，造成彌散。

5.3部分區(qū)域不著色 ①脫蠟不完全；②切片部分區(qū)域干燥。

5.4各種孵育結(jié)果所有抗體均不著色 ①H2O2濃度不夠或存放過久失效；②稀釋液中有錯誤的正常血清（如豬抗兔酶標(biāo)抗體稀釋液中有正常兔血清）；③顯色反應(yīng)物溶于脫水的酒精、二甲苯或封片液中。

5.5某些抗體不著色 ①需要消化而沒有消化；②封閉內(nèi)源酶時使抗體活性下降；③切片在裱片或干燥時過熱；④抗體過度稀釋，一抗?jié)舛刃∮诙?；⑤抗體過期或頻繁凍融。

5.6內(nèi)源性酶活性 H2O2-甲醇封閉不恰當(dāng)。

5.7脫片 ①切片無粘附試劑；②切片不干凈；③冰凍切片：組織在貼片前已經(jīng)充分固定。

5.8核輪廓模糊 ①切片已干燥（特別是冰凍切片）；②蘇木素染液欠佳。

5.9非特異性色淀 ①底物-顯色液使用前未經(jīng)過濾；②抗體使用前未離心。

5.10陽性反應(yīng)太弱 ①抗體或其它試劑活性下降；②顯色反應(yīng)時間過短；②某些抗體的稀釋度或孵育時間不夠；④滴加抗體時切片上緩沖液過多。

5.11切片鏡下模糊或黑點(diǎn)沉著 ①脫水不徹底：進(jìn)入二甲苯前加一步等量石炭酸/二甲苯混合液；②溫箱干燥替代脫水過程

編輯/周蕓霏