結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法的創(chuàng)新進展研究

摘要：結(jié)核病是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題，也是我國重點控制的主要疾病之一，該疾病是由單一因素所致的感染性疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高的臨床特點，相關(guān)的研究資料表明，目前約有800萬的新發(fā)結(jié)核病例，且有200～300萬的死亡病例，全球約有1/3的人口受到不同程度的結(jié)核分枝桿菌感染，因此，采取有效的方式快速準確的診斷結(jié)核感染，及時進行化療，防止其傳播十分的重要。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；快速培養(yǎng)法；創(chuàng)新；進展；研究

結(jié)核病的臨床危害性較大，具有發(fā)病率高、死亡率大的特點，且近幾十年來的發(fā)病率一直呈現(xiàn)逐步增長的趨勢[1]。細菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)傳染疾病的重要途徑和主要手段，對肺結(jié)核患者進行痰檢驗，發(fā)現(xiàn)其結(jié)核分枝桿菌是確診肺結(jié)核疾病的主要方法，傳統(tǒng)的涂片抗酸染色檢查的陽性檢出率較低，且較難分辨死菌和活菌，培養(yǎng)法的檢出準確性較高，但是由于結(jié)核菌的生長速度較為緩慢，不利于患者的臨床診斷和治療[2]，因此，對結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)的方法進行創(chuàng)新和思考已成為臨床熱議的焦點，快速培養(yǎng)測定系統(tǒng)可有效縮短檢測時間，且具有快速、靈敏、準確性高的特點[3]。本文就結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法的創(chuàng)新進展，對噬菌體生物擴增法和結(jié)核分枝桿菌L型檢測的培養(yǎng)概況進行了綜述，現(xiàn)報道如下。

1 噬菌體生物擴增法

1.1噬菌體的特性 噬菌體包括真菌和古細菌，是原核生物病毒，又被稱為細菌病毒。噬菌體的個體較小，可通過細菌濾器，且具有其他病毒共同的特性，噬菌體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成的外殼和包于其中的核酸組成，且不具有獨立的代謝酶系，是一種專性的細胞內(nèi)寄生菌，主要存活于活著并進行代謝的宿主細胞中，在該類細胞中進行生長和復(fù)制[4]。噬菌體感染細菌具有種屬特異性，一個噬菌體只能感染一個細菌種屬，有時也可感染一個種屬的幾株細菌，目前，噬菌體技術(shù)在各種細菌感染性疾病的診斷和治療方面取得了十分成功的應(yīng)用[5]。

1.2噬菌體生物擴增法簡述 噬菌體生物擴增法是指將噬菌體應(yīng)用于快速檢測結(jié)核分枝桿菌的技術(shù)，噬菌體D29可以感染生長緩慢的結(jié)核分枝桿菌，包括金色、偶然、胞內(nèi)、草分枝桿菌等幾種非結(jié)核分枝桿菌，檢測結(jié)果通過快速生長恥垢分枝桿菌進行反映，噬菌體的增殖速度較快，在24h內(nèi)，噬菌體浸染的細菌被裂解，進而形成無菌區(qū)域，如果繼續(xù)培養(yǎng)不會繼續(xù)增大，因此，可以以較快的速度反映標本中是否存在活的結(jié)核分枝桿菌，同時可用于檢測抗結(jié)核藥物的敏感性[6]。

1.3噬菌體生物擴增法的檢測原理 噬菌體D29在與結(jié)核分枝桿菌混合孵育時，可以對活的結(jié)核分枝桿菌造成感染，加入殺毒劑后，結(jié)核分枝桿菌體外的噬菌體滅活，且菌體內(nèi)的噬菌體不會受到影響，噬菌體在菌體內(nèi)大量的繁殖和裂解，進而釋放子代噬菌體，噬菌體在感染和裂解后，進而與指示細胞發(fā)生反應(yīng)，瓊脂培養(yǎng)基可在指示細胞裂解后形成噬菌斑[7]，且噬菌斑的數(shù)目和標本內(nèi)活的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量呈正比的關(guān)系，但是如果標本中不含有結(jié)核分枝桿菌，那在經(jīng)殺毒劑處理后，痰液中的無噬菌可以較好的存活。噬菌體生物擴增法檢測后的18～24h可判讀結(jié)果，小于等于10個噬菌斑為陰性，大于等于20個噬菌斑為陽性[8]。

1.4噬菌體生物擴增法的臨床應(yīng)用分析 胡忠義[9]在《噬菌體生物擴增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌方法學(xué)研究》一文中就建立噬菌體生物擴增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌試驗方法，探討最佳檢測條件這一目的進行了研究分析，應(yīng)用分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，比較各種檢測條件對測定結(jié)果的影響，并將所建方法用于痰標本檢測，研究結(jié)果表明，與BIOTEC Lab公司產(chǎn)品比較，1×109噬菌斑形成單位（PFU）/ml的噬菌體，37℃感染60min可檢出200～500條/ml結(jié)核分枝桿菌，殺毒劑100mmol/ml，室溫作用5min可完全滅活受試噬菌體，指示細胞濃度在1×108條/ml時，形成的噬菌斑清晰。4種非結(jié)核分枝桿菌（偶然、胞內(nèi)、金色、草分枝桿菌）在高濃度時（>1×105條/ml）檢測結(jié)果為陽性，重復(fù)試驗結(jié)果表明，本法批間和批內(nèi)變異系數(shù)均<15%。痰標本氫氧化鈉-半胱氨酸液化方式的陽性檢出率為94%（49/52），顯著高于氫氧化鈉液化結(jié)果的62%（32/52，χ2=15.06，P<0.01）；預(yù)培養(yǎng)1d的陽性檢出率為65%（51/78），顯著高于未預(yù)培養(yǎng)結(jié)果的40%（31/78，χ2=18.05，P<0.01）。最終得出\"噬菌體生物擴增法快速、簡便、靈敏，有助于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測\"這一結(jié)論。

1.5噬菌體生物擴增法的應(yīng)用局限性 噬菌體D29可以對生長較為緩慢的結(jié)核分枝桿菌造成感染，且可以有效感染恥垢、金色、偶然、胞內(nèi)等幾種非結(jié)核分枝桿菌[10]，但我國的非結(jié)核分枝桿菌較為少見。噬菌體生物擴增法的操作影響因素較多，實驗操作過程較為復(fù)雜，實驗過程中需設(shè)立陽性和陰性對照，以確保結(jié)果的可靠性，且噬菌體在痰液成分的保護下可能逃避清除，在60℃的溫度下，作用1min就有可能滅活，因此，需注意澆注器皿的溫度不宜過高[11]。

2 結(jié)核分枝桿菌L型檢測

2.1結(jié)核分枝桿菌L型檢測概述 國外研究資料表明[12]，在體內(nèi)外多種因素的影響下，結(jié)核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)的異變，主要表現(xiàn)出細菌細胞壁完全或部分缺失，這部分變異的細菌在醫(yī)學(xué)上被命名為\"L型菌\"，在藥物誘導(dǎo)及免疫因子作用和自身生活周期中，非結(jié)核及結(jié)核兩種分枝桿菌容易在細胞壁丟失的影響下，形成分枝桿菌L型，臨床上也將該細菌稱為細胞壁缺陷菌，細胞壁缺陷菌由于細胞壁的缺乏或者不完整，分枝菌酸或者磷脂容易全部缺失，因此，常規(guī)的抗酸染發(fā)檢測不容易著色或者著色極淡。除此之外，結(jié)核分枝桿菌L型菌的菌體滲透壓較高，在等滲的普通培養(yǎng)基上溶解容易被破壞，導(dǎo)致采用普通結(jié)核分枝桿菌檢測容易呈現(xiàn)陰性結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌L型檢測具有快速簡便、靈活性高的優(yōu)點[13]。

2.2結(jié)核分枝桿菌L型檢測的臨床應(yīng)用 結(jié)核分枝桿菌的細胞壁脂質(zhì)含量較高，約占總比的60%左右，且大部分的分枝菌酸包圍在肽聚糖層外面，對染料的穿入造成了較大的影響。常規(guī)的抗酸染色可較好的用于分枝桿菌L型的檢測中，但是因為結(jié)核分枝桿菌L型對染料的拒染力較強，因此染色結(jié)果常為陰性，容易導(dǎo)致漏診及誤診情況的出現(xiàn)，但結(jié)核分枝桿菌L型檢測的靈敏度較高，特異性較強，因此可用于痰結(jié)核分枝桿菌的常規(guī)檢測中[14]。趙丹[15]學(xué)者在《結(jié)核分枝桿菌L型檢測對結(jié)核病診療價值的研究》一文中通過探究評價MTB-L涂片染色方法的改進及其方法學(xué)，得出\"MTB-L抗酸染色方法具有良好的靈敏度、特異度，操作簡便易行，適合于痰MTB-L常規(guī)檢測，能夠在基層結(jié)核病實驗室推廣應(yīng)用\"這一結(jié)論，進一步佐證了本文的觀點，具有較好的臨床借鑒價值。

3 小結(jié)

快速培養(yǎng)法具有操作簡單、特異度高、敏感性高的臨床優(yōu)越性，因此，可在臨床中應(yīng)用和推廣，噬菌體生物擴增法和結(jié)核分枝桿菌L型檢測可在結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法中得到良好的應(yīng)用。

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編輯/周蕓霏