大豆轉(zhuǎn)錄因子WRI1基因的生物信息學(xué)分析

摘要：從NCBI查找大豆（Glycine max）基因組中轉(zhuǎn)錄因子WRI1基因，通過(guò)同源比對(duì)在大豆基因組中確定了31個(gè)同源基因。利用在線分析工具和生物信息學(xué)方法對(duì)31個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)存在較大差異，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主要構(gòu)成元件，亞細(xì)胞均定位于細(xì)胞核。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，31個(gè)蛋白質(zhì)的高保守區(qū)域由大約200個(gè)氨基酸殘基組成；正選擇位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)Glyma08g24420.1和Glyma15g34770.1兩個(gè)蛋白質(zhì)序列的第381、382、383個(gè)氨基酸位點(diǎn)受到了正選擇，進(jìn)行了適應(yīng)性進(jìn)化。

關(guān)鍵詞：大豆（Glycine max）；WRI1；生物信息；正選擇位點(diǎn)

中圖分類號(hào)：S565.1；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）13-3482-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.055

植物油脂在人類日常生活中扮演著不可替代的角色，不僅可以作為食用油，還是重要的工業(yè)原料，是生物新能源開發(fā)的重要材料來(lái)源。目前，隨著植物油需求量的增加和消費(fèi)者對(duì)膳食脂肪安全意識(shí)的提高，培育高油量、高質(zhì)量的油料作物已經(jīng)成為育種的主要任務(wù)之一。植物油脂合成過(guò)程涉及許多關(guān)鍵酶，通過(guò)生物學(xué)方法，一些關(guān)鍵酶已經(jīng)確定，如乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸激酶、脂肪酸延長(zhǎng)酶等[1]，抑制或提高這些關(guān)鍵酶的活性可以影響植物種子的含油量。近年來(lái)，研究表明利用轉(zhuǎn)錄因子基因改造植物脂肪代謝過(guò)程，可以更好地提高油脂含量，改善油脂成分。

轉(zhuǎn)錄因子能與基因5′端上游特定序列專一結(jié)合，保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)蛋白質(zhì)分子?？蒲腥藛T通過(guò)抑制或過(guò)表達(dá)手段已經(jīng)研究了一些與油脂合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的功能，例如WRINKLED1、LEAFYCOTYLEDON1、FUSCA3等[2]，其中WRINKLED1研究的比較多。WRI1基因?qū)儆贏P2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族[3]，于1998年首次被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其突變時(shí)種子含油量降低80%，而當(dāng)其過(guò)表達(dá)時(shí)含油量卻提高了20%[4]。作為全球第二大農(nóng)作物，大豆（Glycine max）是重要的蛋白質(zhì)和食用油來(lái)源[5]。本試驗(yàn)以大豆中WRI基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用在線工具和生物信息相關(guān)方法對(duì)該基因及其蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為植物油脂合成品質(zhì)改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料

從JGI（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中下載大豆基因組CDS數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，在NCBI上查找大豆基因組中WRI1基因，獲得其CDS序列。用大豆基因組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)，以WRI1基因的蛋白質(zhì)序列為查詢序列，執(zhí)行BLASTp進(jìn)行同源基因搜索，得到WRI1蛋白質(zhì)的同源序列。

1.2 一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用ExPaSy提供的在線分析工具Protparam[6]（http：//web.expasy.org/protparam/），分析WRI1蛋白質(zhì)序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)，包括氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)、分子量、疏水性等。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用在線分析工具SOPMA[7]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）。

1.3 亞細(xì)胞定位

用ProtComp（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？group=programs subgroup=proloc topic= protcom pan）對(duì)WRI1蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，分析保守結(jié)構(gòu)域。采用MEGA 4.0軟件中的鄰近法，bootstrap值設(shè)為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 正選擇位點(diǎn)分析

分析正選擇的方法：在密碼子水平上分析核酸替換，非同義突變率（dN）與同義突變率（dS）的比值可以用來(lái)衡量選擇壓力，進(jìn)而判斷自然選擇對(duì)非同義突變的固定具有促進(jìn)還是抑制作用[8]，用ω= dN/dS表示。ω=1，表示發(fā)生中性選擇；ω<1，表示發(fā)生凈化選擇；ω>1，表示受到正選擇。本試驗(yàn)采用Paml 4.7軟件包中的Codeml子程序計(jì)算ω值，采用位點(diǎn)模型N Sites，同時(shí)選擇M0、M1、M2、M7和M8模型，運(yùn)行Codeml程序。在結(jié)果中找到Model 7和Model 8的InL值，進(jìn)行LRT檢驗(yàn)，計(jì)算2△InL。然后用Chi2程序進(jìn)行卡方（χ2）檢驗(yàn)，自由度取2，若檢驗(yàn)結(jié)果中P小于0.05，說(shuō)明備擇假設(shè)模型成立。最后，通過(guò)貝葉斯經(jīng)驗(yàn)檢驗(yàn)（BEB）和NBE檢驗(yàn)獲得每個(gè)氨基酸位點(diǎn)的后驗(yàn)概率，同時(shí)Model 2和Model 8檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)被作為最后確認(rèn)的正選擇位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 WRI1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

同源基因搜索得到31條序列，由表1可見，31個(gè)蛋白質(zhì)所含氨基酸數(shù)目在290～710不等，Glyma18g47980.2所含氨基酸數(shù)目最多，Glyma07g-02380.1含有氨基酸數(shù)目最少，分子量在33 105.3～78 008.9之間；8個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大于7.5，顯堿性，15個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)小于6.5，顯酸性；大部分蛋白質(zhì)中含量最多的氨基酸是Ser；除Glyma08g-38190.2和Glyma18g29400.2的不穩(wěn)定系數(shù)小于40.00，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其他蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40.00，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；平均疏水性均為負(fù)值，屬于親水蛋白質(zhì)。31個(gè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件，以α-螺旋為次要構(gòu)成元件，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈的百分比最少。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，31個(gè)WRI1蛋白質(zhì)均定位于細(xì)胞核。

2.2 WRI1保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ClustalX軟件對(duì)31個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖1所示。31個(gè)蛋白質(zhì)序列中間的保守性要強(qiáng)于兩端，其保守結(jié)構(gòu)域由大約200個(gè)氨基酸殘基組成。

采用MEGA 4.0軟件的鄰近法，bootstrap值為1 000，構(gòu)建WRI1蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，31個(gè)蛋白質(zhì)大體上分為2個(gè)分支，Glyma08g24420.1和Glyma15g34770.1最為古老，推測(cè)是進(jìn)行了適應(yīng)性進(jìn)化。結(jié)合多序列比對(duì)結(jié)果，Glyma11g14040.1的保守結(jié)構(gòu)域中也有一段特殊的氨基酸序列（圖1中框住部分）。

2.3 正選擇分析

利用Paml 4.7軟件包中的Codeml程序?qū)?個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行正選擇位點(diǎn)分析，用Model 7和Model 8的InL值做LRT檢驗(yàn)，取自由度df=2，然后進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，所得結(jié)果（表2）中 Glyma08g24420.1和Glyma15g34770.1的P值分別為7.575×10-6和4.515×10-6，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，備擇假設(shè)模型成立，進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)。Glyma11g14040.1的P值為0.425，備擇假設(shè)模型不成立，不再進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)。

BEB后驗(yàn)結(jié)果顯示，在Glyma08g24420.1蛋白質(zhì)序列中有3個(gè)位點(diǎn)受到正選擇，分別是第381、382、383個(gè)氨基酸位點(diǎn)，Model 2和Model 8同時(shí)檢測(cè)到這3個(gè)位點(diǎn)受到正選擇，將后驗(yàn)概率和ω值列于表3中。

在Glyma15g34770.1蛋白質(zhì)序列中有3個(gè)位點(diǎn)受到正選擇，分別是第381、382、383個(gè)氨基酸位點(diǎn)，Model 2和Model 8同時(shí)檢測(cè)到這3個(gè)位點(diǎn)受到正選擇，將后驗(yàn)概率和ω值列于表4中。

3 小結(jié)

近年來(lái)，基因組測(cè)序工作的開展為大豆基因組的研究提供了新契機(jī)，對(duì)認(rèn)識(shí)其生物學(xué)機(jī)制，并在分子水平上改進(jìn)大豆品質(zhì)有重大意義。所以，在完成了較單純的大豆全基因組測(cè)序后[9]，更多重測(cè)序工作深入開展[10，11]。本試驗(yàn)從NCBI中查找得到大豆基因組中WRI1基因的CDS序列和蛋白質(zhì)序列。用其CDS序列和大豆基因組CDS數(shù)據(jù)做blastp比對(duì)，得到31個(gè)基因。

利用在線工具和生物信息學(xué)方法對(duì)31個(gè)基因序列和蛋白質(zhì)序列做了初步分析。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)31個(gè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)存在明顯差異，氨基酸數(shù)目為290～710，分子量為33 105.3～78 008.9；8個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大于7.5，呈堿性，15個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)小于6.5，呈酸性；大部分蛋白質(zhì)中含量最多的氨基酸是Ser；Glyma08g38190.2和Glyma18g29400.2的不穩(wěn)定系數(shù)小于40.00，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其他蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40.00，屬不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；平均疏水性都是負(fù)值，屬于親水蛋白質(zhì)；31個(gè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋為主要構(gòu)成元件，含量在70%以上；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)31個(gè)蛋白質(zhì)都定位于細(xì)胞核；正選擇位點(diǎn)分析結(jié)果顯示Glyma08g24420.1和Glyma15g34770.1的第381、382、383個(gè)氨基酸位點(diǎn)都受到了正選擇。WRI1基因在植物油脂合成過(guò)程起著重要的作用，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行研究，分析其理化性質(zhì)和選擇壓力，將為培育高油脂作物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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