魔芋愈傷誘導(dǎo)的多因子正交試驗(yàn)

摘要：研究花魔芋（Amorphophallus albus）愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素組合培養(yǎng)條件。以魔芋葉柄為外植體，采用4因素3水平正交試驗(yàn)研究2，4-D、NAA、6-BA與KT 4種激素對(duì)魔芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，2，4-D、NAA、6-BA與KT對(duì)魔芋葉柄外植體膨大與愈傷組織形成具有顯著效應(yīng)。利于外植體膨大的最優(yōu)激素組合為MS+3.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT；利于愈傷組織積累的最優(yōu)激素組合為MS+1.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT。試驗(yàn)優(yōu)化的激素組合條件下魔芋外植體膨大與愈傷誘導(dǎo)有較佳的表現(xiàn)，可用于花魔芋的培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：花魔芋（Amorphophallus albus）；植物激素；膨大率；誘導(dǎo)率；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S632 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）13-3479-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.054

魔芋為天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物，具有發(fā)達(dá)的地下塊莖，富含有果膠、生物堿、淀粉、17種氨基酸和多種微量元素[1]。魔芋的主要活性成分是魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan），具有降血糖、降血脂、治療糖尿病等作用[2-5]，在醫(yī)藥方面具有廣泛的利用價(jià)值。中國(guó)魔芋種質(zhì)資源豐富，其中花魔芋（Amorphophallus albus）分布最廣。魔芋種植過(guò)程中種芋自然繁殖系數(shù)低，且易感病與腐爛，發(fā)病后產(chǎn)量一般損失30%～50%，甚至可能造成大面積絕收[6]，嚴(yán)重阻礙了魔芋大面積種植與相關(guān)深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。愈傷組織是具有強(qiáng)分生能力的原始細(xì)胞團(tuán)，通過(guò)對(duì)愈傷組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化和化學(xué)誘導(dǎo)可較快地獲得抗病新品種，能夠解決種芋攜帶病原菌的問(wèn)題，是解決魔芋種質(zhì)退化的有效途徑。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法，研究不同激素種類與濃度對(duì)魔芋葉柄外植體啟動(dòng)脫分化與愈傷組織形成的影響，可為優(yōu)化魔芋愈傷培養(yǎng)條件、促進(jìn)魔芋種質(zhì)篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為漢中市當(dāng)?shù)厍褰ㄓ?號(hào)，由陜西漢中洋縣新成魔芋菌業(yè)科技有限公司提供；外植體取自魔芋試管苗的幼嫩葉柄，魔芋試管苗由陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁育保存。試驗(yàn)用2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）與呋喃氨基嘌呤（KT）均為分析純；MS為基本培養(yǎng)基，自配。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基設(shè)計(jì) 魔芋愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選采用4因素3水平正交試驗(yàn)，以2，4-D、NAA、6-BA與KT為試驗(yàn)因素，以膨大率、誘導(dǎo)率為指標(biāo)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.2.2 材料處理與誘導(dǎo) 魔芋試管苗培養(yǎng)至20 d，選擇大小均一、生長(zhǎng)勢(shì)一致的魔芋試管苗，無(wú)菌操作條件下取葉柄，并將其切分為長(zhǎng)1 cm的小段，隨機(jī)接種至添加不同激素種類與濃度的MS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)外植體，每瓶接種5個(gè)，置于溫度為（25±2） ℃、相對(duì)濕度50%～60%的條件下，黑暗培養(yǎng)。定期觀察外植體的形態(tài)變化，培養(yǎng)第14天統(tǒng)計(jì)膨大的外植體數(shù)目，第21天統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)目，并計(jì)算膨大率與誘導(dǎo)率。

1.2.3 計(jì)算方法 膨大率=膨大外植體的數(shù)目/接種外植體總數(shù)×100%；誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，將整理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析與ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)魔芋葉柄外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將魔芋葉柄切段接種到試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9種培養(yǎng)基后，觀察外植體的形態(tài)變化與愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間、質(zhì)地、顏色等，結(jié)果表明，接種第3天外植體切口處出現(xiàn)明顯膨大，第5天組織塊增大變厚，并在葉柄一端或兩端形成少量愈傷組織。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分外植體切口端開(kāi)裂，顆粒狀愈傷組織體積不斷增大，愈傷顏色多為乳白色或淡粉色，質(zhì)地疏松或致密。不同激素種類與濃度處理下，外植體的膨大與愈傷誘導(dǎo)情況差異較大（表2）。

2.2 不同激素組合對(duì)魔芋葉柄膨大率的效應(yīng)

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素組合處理對(duì)促進(jìn)魔芋葉柄外植體的膨大效應(yīng)明顯，以膨大率為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析（表2）與方差分析（表3）。通過(guò)直觀分析比較4個(gè)因素的極差值，B因素NAA的極差值最大（14.67），其次是A因素2，4-D（12.16），第三為C因素6-BA（6.43），影響最小的是D因素KT（6.41），因此參試的4個(gè)因素對(duì)魔芋葉柄膨大率影響的主次順序?yàn)锽>A>C>D。根據(jù)各因素平均值的大小比較，可得出最佳激素組合為A3B3C2D1。

方差分析（表3）表明，因素A（2，4-D）、因素B（NAA）對(duì)膨大率的效應(yīng)達(dá)到極顯著水平（P<0.01），因素C（6-BA）達(dá)到顯著水平（P<0.05），因素D（KT）效應(yīng)不顯著?？疾斓?個(gè)因素A、B、C、D對(duì)膨大率的決定系數(shù)R2分別為0.807、0.853、0.521與0.478，其綜合貢獻(xiàn)為0.923。綜合以上直觀和方差分析可得出，對(duì)于魔芋葉柄外植體啟動(dòng)脫分化（膨大）的最佳激素組合為A3B3C2D1，即當(dāng)培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT時(shí)，啟動(dòng)脫分化效果最佳。

2.3 不同激素組合對(duì)魔芋葉柄愈傷誘導(dǎo)率的效應(yīng)

試驗(yàn)以魔芋葉柄愈傷誘導(dǎo)率為指標(biāo)分別進(jìn)行直觀分析（表2）與方差分析（表4）。通過(guò)直觀分析比較4個(gè)因素的極差值，A因素2，4-D的極差值最大（26.24），其次是D因素KT（12.30），再次是C因素6-BA（10.17），最小的是B因素NAA（9.36），由此可知考察的4個(gè)因素對(duì)魔芋葉柄愈傷誘導(dǎo)率影響的主次順序?yàn)锳>D>C>B。根據(jù)各因素平均值的大小比較，可得出最佳激素組合為A1B3C2D3。

方差分析（表4）表明，因素A（2，4-D）、因素B（NAA）、因素C（6-BA）與因素D（KT）對(duì)魔芋愈傷誘導(dǎo)率的效應(yīng)均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。參試的4個(gè)因素A、B、C、D對(duì)魔芋葉柄愈傷誘導(dǎo)率的決定系數(shù)R2分別為0.970、0.835、0.894與0.861，其綜合貢獻(xiàn)為0.981。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果可得出，魔芋葉柄外植體愈傷誘導(dǎo)率的最佳激素組合為A1B3C2D3，即當(dāng)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT時(shí)，愈傷誘導(dǎo)效果最佳。

3 小結(jié)與討論

目前，關(guān)于魔芋愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)條件，一般采用單一或兩種激素進(jìn)行不同激素組合之間的誘導(dǎo)率比較。郭政宏等[7]研究6-BA和NAA組合對(duì)魔芋球莖與鱗片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，表明二者分別為1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果較佳。魯紅學(xué)等[8]研究表明，0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的花魔芋球莖的愈傷誘導(dǎo)率最高，KT作用不明顯。王貴元等[9]研究了幾種因素對(duì)魔芋葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響，表明0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是魔芋葉柄愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。由于影響魔芋愈傷組織誘導(dǎo)的因素非常多，如果考慮所有因素，工作量大，而考慮因素太少又無(wú)法較好地消除無(wú)關(guān)變量的影響，因此要獲取最佳培養(yǎng)條件就必須篩選關(guān)鍵作用變量，優(yōu)化因素水平。正交試驗(yàn)是一種理想的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，能較好地克服試驗(yàn)設(shè)計(jì)的盲目性，增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究將生長(zhǎng)素類2，4-D、NAA與細(xì)胞分裂素類6-BA與KT 4個(gè)因素同時(shí)考慮，優(yōu)選試驗(yàn)激素配比條件。篩選出利于魔芋葉柄外植體啟動(dòng)脫分化的最優(yōu)激素組合為MS+3.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT；利于愈傷組織積累的最佳激素組合為MS+1.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT。

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