藤茶γ—氨基丁酸含量測定方法研究

摘要：研究適合藤茶中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的提取和測定方法，結(jié)果表明，利用丙酮和AlCl3能有效去除藤茶中的色素，采用分光光度法能準確測定藤茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量。對市場上5種藤茶產(chǎn)品中的GABA進行了測定，結(jié)果表明，GABA含量最高的為須茶，其GABA含量為0.727 mg/g，含量最低的為雅露，其GABA含量為0.532 mg/g，平均GABA含量為0.635 mg/g。

關(guān)鍵詞：藤茶；γ-氨基丁酸；測定；比色法

中圖分類號：S888.2；O657.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3453-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.046

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，廣泛存在于動植物體內(nèi)，具有降血壓、保持神經(jīng)安定，改善大腦機能和增強記憶等多種藥理作用[2]，具有較大的開發(fā)和利用價值。鮮茶葉經(jīng)過一定時間的厭氧處理使谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用下脫去羧基生成GABA，日本學(xué)者通過厭氧和應(yīng)激處理，使普通春茶中GABA的含量達到2.02 mg/g，夏茶GABA的含量達到0.86～1.14 mg/g[3]，而普通加工的茶葉雖然谷氨酸的含量豐富達到1.78～4.95 mg/g，但GABA只為0.2～2.0 μmol/g[4]，相當于0.02～0.22 mg/g。

藤茶（Ampelopsis grossedentata）是一種古老的藥食兩用植物，作為類茶植物和中草藥在民間長期廣泛使用，近年逐漸成為研究熱點[5-7]。研究顯示藤茶鮮葉中谷氨酸含量達到了3.25 mg/g[8]，迄今國內(nèi)外尚鮮見利用富含谷氨酸的藤茶為材料生產(chǎn)GABA的報道。本研究以藤茶為材料，研究其GABA的提取和測定方法，并對目前市場上商品藤茶的GABA含量進行了測定，以期為藤茶功能成分的進一步開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

藤茶成品（雅露、雅曲、鳳珠、芽茶、須茶）購于來湖北省恩施州來鳳縣鳳雅藤茶生物有限公司；藤茶鮮葉采集于來鳳縣大河鎮(zhèn)兩河口集鎮(zhèn)藤茶基地，品種為綠鳳[9]。丙酮、甲醇、無水氯化鋁和氫氧化鉀購于天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇、次氯酸鈉和γ-氨基丁酸標準品購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；重蒸酚購于北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉購于天津市天達凈化材料精細化工廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

小型高速冷凍離心機，Eppendorf公司；精密pH計（PHS-4C型），成都方舟科技開發(fā)公司；恒溫水浴鍋（HH-4型），金壇市科興儀器廠；粉碎機，廣東天際電器有限公司；電子天平，上海精天電子儀器有限公司；紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司；移液槍，Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶劑的選擇 取藤茶成品，研磨粉碎，稱取0.5 g樣本3份，分別加入裝有相同體積的甲醇、丙酮和氯仿的離心管中，室溫振蕩10 min，比較3個離心管中溶液的顏色，確定試驗所用提取溶劑。

1.3.2 藤茶中GABA的提取 稱取0.5 g藤茶烘干樣品，加入裝7 mL丙酮的離心管中，室溫振蕩15 min，8 000 r/min離心15 min，棄上清。分別再加7 mL和5 mL丙酮，重復(fù)上述過程，沉淀靜置干燥。待干燥后，加水5 mL，50 ℃水浴中振蕩提取2 h，8 000 r/min離心15 min，小心取出上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 藤茶中GABA的含量測定 分別取1 mL樣品提取液，加入2 mol/L的AlCl3溶液50 μL，混勻后室溫振蕩15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL加入1 mol/L的KOH溶液300 μL，室溫振蕩5 min，12 000 r/min離心5 min。分別取上清液300 μL，加0.1 mol/L的四硼酸鈉緩沖溶液500 μL（pH 10.0），6%的重蒸酚400 μL，混勻后再加入600 μL 5%的NaClO溶液，充分混勻。于沸水浴中加熱10 min，立即置水浴中5 min，待溶液出現(xiàn)藍綠色后，加入2.0 mL 60%乙醇，于645 nm波長處測定吸光度。藤茶中GABA的含量（mg/g）=C×V/m。式中，C是由直線方程計算的值，單位mg/mL；V為樣品提取液的總體積，單位mL；m為樣品質(zhì)量，單位g。

1.3.4 標準曲線的繪制 準確稱取GABA標準品0.010 g，用蒸餾水溶解定容10 mL，再配制成不同濃度的標準溶液。分別取1 mL不同濃度的標準液進行檢測。以吸光度為縱坐標，GABA的濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑的提取效果比較

用甲醇、丙酮和氯仿3種試劑處理，甲醇和氯仿處理后溶液顏色淺而殘留物顏色深，提取效果不好；丙酮處理后溶液顏色深且殘留物顏色淺，顯示其提取效果遠好于甲醇和氯仿（表1），所以試驗使用丙酮作為提取溶劑。

2.2 新鮮藤茶與烘干藤茶中GABA的含量的比較

采集綠鳳藤茶嫩葉，稱取相同重量的4份樣品分別取2份烘干，2份保持新鮮，比色法測定4份樣品的吸光度。從表2可以看出相同質(zhì)量的藤茶樣本鮮葉中GABA的含量比烘干葉中的GABA含量高（表2）。

2.3 標準曲線的繪制

以GABA的濃度為橫坐標（x），以吸光度為縱坐標（y），繪制標準曲線得圖1。可見，GABA含量與其在645 nm處的吸光度間具有良好的線性關(guān)系，y=0.369 7x+0.014 1，R2=0.991 4。

2.4 藤茶中GABA含量的測定

利用比色法共測定5種類型的市售藤茶商品，結(jié)果顯示5種藤茶商品中，GABA的含量范圍為0.532～0.727 mg/g，其中須茶GABA的含量最高，雅露的含量最低（表3），GABA的平均含量為0.635 mg/g。方差分析表明雅露、雅曲和鳳珠間GABA含量差異不顯著（P>0.05），而雅露和芽茶、雅露與須茶間差異顯著（P<0.05），芽茶和須茶之間GABA含量差異不顯著（P>0.05）。

3 小結(jié)與討論

高等植物中GABA主要由L-谷氨酸脫羧而來，這一反應(yīng)由L-谷氨酸脫羧酶催化，L-谷氨酸可自身激活L-谷氨酸脫羧酶的活性[10]，植物體內(nèi)谷氨酸含量對GABA的積累起著重要調(diào)節(jié)作用。從試驗結(jié)果可以看出藤茶中GABA的含量為0.532～0.727 mg/g，明顯高于文獻報道到普通茶中GAGA的含量（0.02～0.22 mg/g），這與藤茶中谷氨酸的含量明顯高于普通茶中的谷氨酸含量吻合，較高的谷氨酸含量可能有利于谷氨酸脫羧酶活性的提高，促進GABA的積累。

供試5種藤茶成品均為鳳雅藤茶生物有限公司2014年6～8月生產(chǎn)，其中雅露和雅曲為藤茶老葉精制而成，雅曲包裝精美；鳳珠藤茶為老葉烘焙加工成珠狀茶，包裝精美；芽茶和須茶為藤茶高檔茶，為新芽加工而成，芽須原料嚴格甄選，精致烘焙，包裝考究。試驗結(jié)果顯示雅露GABA含量最低，為0.532 mg/g，而須茶GABA含量最高，為0.727 mg/g；方差分析也表明老葉加工的雅露、雅曲和鳳珠3種藤茶成品間GABA含量沒有顯著差異，新芽須加工而成的芽茶和須茶間GABA含量亦沒有顯著差異；而雅露和雅曲為代表的老葉茶與芽茶和須茶之間GABA含量達到顯著差異（P<0.05）。表明藤茶幼嫩葉片中的GABA含量相對于老化的葉片更高；這點也可能影響到產(chǎn)品的定位，隨著藤茶檔次的提高，GABA含量遞增。冀憲領(lǐng)等[11]也有報道，桑樹幼嫩的葉片中的GABA含量相對于老化的葉片更高，這點上與藤茶一致。

另一方面，新鮮藤茶中GABA含量比烘干藤茶中GABA高，提示藤茶在烘焙過程中部分GABA可能被降解，進而導(dǎo)致GABA含量下降，所以宜選用新鮮藤茶葉片來提取GABA。在藤茶成品加工過程中通過優(yōu)化控制烘焙過程，在不影響藤茶成品生產(chǎn)前提條件下最大限度降低GABA的損耗，以及通過諸如厭氧處理調(diào)控L-谷氨酸脫羧酶活性增加藤茶成品中GABA含量，有待進一步研究。

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