真空包裝肘花脹袋微生物的鑒定及驗(yàn)證

摘要：以正常和腐敗的產(chǎn)品為材料研究引起真空包裝肘花脹袋的微生物，將傳統(tǒng)培養(yǎng)與分子生物學(xué)方法（16S rDNA序列分析和PCR-DGGE技術(shù)）相結(jié)合對(duì)分離純化的微生物進(jìn)行鑒定，并將分離到的細(xì)菌進(jìn)行回接驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，比較從正常和脹袋產(chǎn)品中分離純化到的14株和18株菌發(fā)現(xiàn)，脹袋組中含有對(duì)照組沒有的細(xì)菌。16S rDNA的分析結(jié)果顯示這些菌株主要是芽孢桿菌[枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）]以及寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia和Stenotrophomonas pavanii）；而PCR-DGGE分析結(jié)果表明這些菌株主要是包括產(chǎn)氣莢膜梭茵（Clostridium perfringens）在內(nèi)的梭狀芽孢桿菌（Clostridium sp.）和假單胞菌（Pseudomonas sp.），將分離到的細(xì)菌回接到樣品中，產(chǎn)品即發(fā)生脹袋，可見，引起肘花脹袋的微生物是芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌。

關(guān)鍵詞：肘花；脹袋；微生物；枯草芽孢桿菌；寡養(yǎng)單胞菌；PCR-DGGE

中圖分類號(hào)：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）13-3434-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.041

肘花是以豬皮和豬瘦肉為原料的深加工產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)，味道鮮香，頗受消費(fèi)者青睞[1]。但因其營養(yǎng)豐富，水分含量較高，腐敗微生物極易生長和繁殖，加上加工所用的原輔料種類繁多、來源復(fù)雜，源頭污染和二次污染都難以徹底控制，采用傳統(tǒng)的高溫法處理，一部分耐熱微生物仍能殘存，極易導(dǎo)致微生物繁殖，引起腐敗[2]，出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象，直接影響到企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[3]。找到導(dǎo)致脹袋的微生物，采取預(yù)防措施對(duì)生產(chǎn)企業(yè)來說就顯得尤為重要。

常規(guī)的腐敗微生物檢測大多數(shù)是依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)法進(jìn)行分離，然后根據(jù)菌落形態(tài)及生理生化特征確定其類型[4]。該方法耗時(shí)長（一般需要2～5 d），操作復(fù)雜，對(duì)培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)條件依賴性強(qiáng)，且自然界中只有0.1%～1.0%的微生物能夠通過常規(guī)方法被培養(yǎng)，導(dǎo)致結(jié)果不夠準(zhǔn)確[5]，而PCR技術(shù)具有特異性高、敏感快速、簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足。近年來，通過變性劑梯度分離不同DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)也被越來越廣泛地應(yīng)用于食品中微生物的檢測[6]。張琦等[7]在郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究中發(fā)現(xiàn)了Staphylococcus xylosus、Lactobacillus plantarum、Weissella confusa等細(xì)菌。Jiang等[8]使用PCR-DGGE指紋技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，研究切片包裝的豬肉在冷藏條件貯存期間微生物群落組成的變化，以及貯存后期主導(dǎo)腐敗菌在整體細(xì)菌總量中的相對(duì)含量。

本研究以正常和脹袋的肘花為材料，將傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，研究引起真空包裝肘花脹袋的微生物。采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，對(duì)正常和脹袋肘花產(chǎn)品中的微生物進(jìn)行分離純化，經(jīng)16S rDNA鑒定以及對(duì)樣品中細(xì)菌宏基因組總DNA可變區(qū)V6～V8區(qū)的PCR-DGGE分析，比較脹袋前后產(chǎn)品中微生物群落的變化，從而推測引起產(chǎn)品脹袋的微生物種類，并將分離到的細(xì)菌回接產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，旨在找到引起產(chǎn)品脹袋的細(xì)菌，從而為企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)中解決問題提供參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

成都市某食品廠提供的正常和脹袋水晶肘花產(chǎn)品。

1.2 方法 可培養(yǎng)微生物的分離、純化與鑒定

參考GB 4789.2-2012[9]的方法處理樣品，梯度稀釋后按下述方法進(jìn)行接種培養(yǎng)[5，10]。

1）好氧菌培養(yǎng)。接種了各稀釋度樣品的營養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)48 h后，根據(jù)不同形態(tài)（顏色、大小等）挑取典型菌落進(jìn)行分離純化。

2）厭氧菌培養(yǎng)。接種了各稀釋度樣品的厭氧瓊脂平板，36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取典型菌落進(jìn)行分離純化。

3）細(xì)菌基因組DNA提取和16S rDNA序列擴(kuò)增。挑取純化后的單菌落進(jìn)行富集培養(yǎng)，取1.5 mL培養(yǎng)液，用TIANamp Bacteria DNA kit（細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒）提取基因組DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板。PCR擴(kuò)增通用引物[11]：Eu27F（5′-GAGA

GTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-CTACGG CTACCTTGTTACGA-3′）。50 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，Taq DNA聚合酶 0.25 μL，引物各1 μL，ddH2O 32.75 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸90 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度為1 500 bp左右，Universal DNA Purification kit（DNA純化回收試劑盒）膠回收后，置于-20 ℃儲(chǔ)藏備用。

4）PCR-DGGE技術(shù)分析微生物種類。分別取25 g對(duì)照和脹袋樣品，加入0.85%生理鹽水，勻漿制成10倍稀釋液，取1.5 mL勻漿液 800 r/min 離心 2 min，取上清液12 000 r/min離心5 min，5管富集，用TIANamp Bacteria DNA kit提取宏基因組DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板。采用Nested PCR 法。先用通用引物 Eu27F和1492R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，反應(yīng)程序同上。然后用帶GC clamp（5′CGCCCGCC GCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG3′）的通用引物GC-968f（5′-GC clamp-AACGCGAAGAACCTTAC-3′）和1401r（5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′）[12]，經(jīng)Touch down-PCR擴(kuò)增16S rDNA V6-V8區(qū)，反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，61～ 56 ℃ 30 s（每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃ 60 s，11個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[11]。PCR反應(yīng)體系均為（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物各1 μL，ddH2O 21 μL，模板 DNA 2 μL。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；隨后通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Recondition PCR去除嵌合體以及異源雙鏈的影響，程序參考文獻(xiàn)[13]。16S rDNA V6～V8區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度為490 bp左右[14]。對(duì)細(xì)菌16S rDNA V6～V8區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳、染色及圖像分析[15-17]。切膠回收代表性條帶，加入40 μL TE Buffer 4 ℃浸泡過夜，取上清液為模板，用不含GC clamp的引物968f和1401r再次擴(kuò)增16S rDNA V6～V8區(qū)，反應(yīng)程序同上，反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP4 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，引物各1 μL，ddH2O 30.5 μL，模板DNA 4 μL。

1.3 序列分析

由上海英駿（Invitrogen）生物科技有限公司完成產(chǎn)物測序。測序結(jié)果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast相似序列檢索，并于GenBank獲得序列登錄號(hào)。使用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行比對(duì)，MEGA 5軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

從分離純化的細(xì)菌中選取有代表性的菌株，接種于肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行活化，于搖床中36 ℃振蕩培養(yǎng)16 h。稀釋菌液，調(diào)節(jié)菌液濃度OD600 nm在0.1左右，備用。將肘花樣品切成5 cm×5 cm的圓形切塊，分裝于真空包裝袋中，用移液槍吸取50 μL菌液涂于樣品表面，抽真空熱封，該部分試驗(yàn)在無菌操作間進(jìn)行，接種后的產(chǎn)品在36 ℃培養(yǎng)箱中放置觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化結(jié)果

接種后的平板在36 ℃培養(yǎng)48 h，綜合營養(yǎng)瓊脂和厭氧兩種培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)（大小、顏色），挑取有代表性的菌落進(jìn)行分離純化，對(duì)照組與脹袋組分別得到14株和18株純化菌株。

2.2 16S rDNA序列分析

分別以兩組樣品中分離純化的32株菌的總DNA為模板，用16S 通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段為1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序得到各菌株的16S rDNA序列。各序列在NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)后，從GeneBank下載親緣關(guān)系相近種的模式菌株（或已發(fā)表菌株）序列，基于16S rDNA序列，對(duì)32株菌及下載菌株的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以Neighbor- Joining分析法，經(jīng)過500次計(jì)算，得到系統(tǒng)發(fā)育樹。

將對(duì)照組中分離到的14株菌的16S rDNA序列進(jìn)行Blast比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)遺傳距離確定其最相似菌株，結(jié)果見表1。從表1和圖1中可以看出，對(duì)照組中分離的14株可培養(yǎng)細(xì)菌主要是腸桿科細(xì)菌，包括泛團(tuán)菌屬（Pantoea sp.）、Enterobacter cloacae和Enterobacter ludwigii在內(nèi)的腸桿菌屬（Enterobacter sp.）。這14株菌均嗜中溫，普遍存在于植物表面、水和土壤中。

脹袋組中分離到的18株菌的16S rDNA序列分析結(jié)果見表2。從表2和圖2可以看出，脹袋組分離得到的18株菌主要包括四類，其中9株為泛團(tuán)菌屬（Pantoea sp.）和Enterobacter ludwigii、Enterobacter cloacae在內(nèi)的腸桿菌屬細(xì)菌（Enterobacter sp.），剩余9株B1、B2、B3、B4、B5、B7、B8、B9和B10為包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）在內(nèi)的芽孢桿菌以及寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia、Stenotrophomonas pavanii）。根據(jù)表2的結(jié)果比較分析，脹袋組中除了含有對(duì)照組分離到的泛團(tuán)菌屬和腸桿菌屬細(xì)菌外，還分離得到枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等芽孢桿菌以及寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌，推測產(chǎn)品脹袋可能是由芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌引起的。

2.3 PCR-DGGE結(jié)果分析

對(duì)照組和脹袋組中樣品的PCR-DGGE指紋圖譜見圖3，DGGE條帶經(jīng)測序比對(duì)，序列鑒定結(jié)果見表3。由圖3和表3可知，對(duì)照組中的細(xì)菌主要為Enterobacter sp.和Staphylococcus aureus，而脹袋組中的細(xì)菌除此之外，還有包括產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）在內(nèi)的梭狀芽孢桿菌（Clostridium sp.），而且條帶非常亮，說明脹袋后，產(chǎn)品中細(xì)菌的種類和數(shù)量發(fā)生了變化，腸桿菌Enterobacter sp.的生長可能受到抑制而數(shù)量較少，而梭狀芽孢桿菌則大量增殖并成為優(yōu)勢菌株（與對(duì)照相比，出現(xiàn)新的條帶，條帶多而且亮），因此，產(chǎn)品脹袋可能是由梭狀芽孢桿菌引起的。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

從對(duì)照組和脹袋組中分離純化到的菌株中分別選取A13（Enterobacter sp. strain YT4）、B1（Bacillus subtilis strain HB-6）、B2（Stenotrophomonas maltophilia strain MTH20）、B3（Bacillus licheniformis strain ML1）、B4（Bacillus subtilis strain SBRh5）、B9（Bacillus licheniformis ATCC 14580）和B10 （Stenotrophomonas pavanii strain LMG 25348）為試驗(yàn)菌株，將稀釋后的菌液回接于產(chǎn)品中，同時(shí)以未接種的樣品為空白對(duì)照。產(chǎn)品于36 ℃放置，觀察結(jié)果。由表4可以看出，產(chǎn)品在接種B組菌液2 d后即出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象，36 ℃放置5 d后，這種現(xiàn)象更加明顯，結(jié)果與“2.2”的結(jié)果一致，將脹袋中產(chǎn)品分離到的細(xì)菌重新回接時(shí)，能夠引起產(chǎn)品脹袋，而對(duì)照組和空白對(duì)照則沒有發(fā)生脹袋。因此，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，將分離到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌回接產(chǎn)品后，產(chǎn)品即出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象，說明引起產(chǎn)品脹袋的微生物主要是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌。

3 討論

本研究將傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法（16s rDNA和PCR-DGGE技術(shù)）相結(jié)合，通過比較對(duì)照組和脹袋組樣品中細(xì)菌種類的不同，對(duì)引起真空包裝肘花產(chǎn)品脹袋的微生物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，這些細(xì)菌主要是芽孢桿菌、寡養(yǎng)單胞菌和梭狀芽孢桿菌，后續(xù)的回接試驗(yàn)證實(shí)了芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌與樣品的脹袋有直接關(guān)系。

有關(guān)寡養(yǎng)單胞菌能夠引起食品腐敗的研究較少，而對(duì)芽孢桿菌的研究相對(duì)較多，芽孢桿菌（Bacillus sp.）在自然界中廣泛存在，因此在食品的加工過程中很容易污染食品[18]，大量研究也表明芽孢桿菌是肉制品中的常見腐敗菌，它能利用糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分生長，形成內(nèi)生孢子，具有較強(qiáng)耐受力，特別是耐熱力，從而逃避熱處理的損傷。食品加工中滅菌或熟制工藝難以將芽孢桿菌完全殺滅，使得該屬細(xì)菌成為食品工業(yè)中較為重要的微生物研究對(duì)象[3]。徐世明等[5]通過對(duì)脹袋烤雞中的腐敗菌進(jìn)行研究，分離出5株腐敗菌，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilu）各兩株。汪立平等[19]從鼓脹的豆?jié){盒里變質(zhì)豆?jié){中分離到3株腐敗菌，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和短芽孢桿菌（Brevibacillus borstelensis）。本試驗(yàn)通過回接試驗(yàn)，驗(yàn)證了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌是產(chǎn)品發(fā)生脹袋的原因。

梭狀芽孢桿菌多為厭氧菌，且耐熱性較強(qiáng)，即使利用真空包裝和高溫高壓等方式也無法完全清除，因此，肉制品中若攜帶有梭狀芽胞桿菌，一般經(jīng)過熟制加工后仍會(huì)有殘留，且在貯存過程中逐漸繁殖，進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)和感官，控制此類細(xì)菌的污染與生長是延長真空包裝食品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于PCR-DGGE方法是直接提取樣品中細(xì)菌的宏基因組總DNA，所以無法驗(yàn)證梭狀芽孢桿菌能夠引起產(chǎn)品脹袋，但是有關(guān)梭菌屬細(xì)菌引起產(chǎn)品脹袋的現(xiàn)象也有相關(guān)研究，孫涪陵等[20]從脹袋火腿腸中分離純化得到一株厭氧菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭茵（Clostridium perfringens）。

通過分析真空包裝脹袋肘花中的腐敗菌，為下一步進(jìn)行腐敗菌溯源提供了依據(jù)，有助于企業(yè)尋找產(chǎn)品污染源頭，對(duì)生產(chǎn)和加工過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)加以重點(diǎn)控制，采用更科學(xué)的滅菌方法，加強(qiáng)產(chǎn)品品質(zhì)。

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