茶葉乙醇提取物清除自由基活性及相關(guān)性分析

摘要：以5種茶葉乙醇提取物為研究對象，測定其茶多酚、茶多糖、黃酮、茶紅素、茶褐素、茶黃素以及茶色素的含量以及清除自由基能力，分析乙醇提取物中活性成分含量與清除自由基能力之間的關(guān)系，并建立回歸模型。結(jié)果表明，不同品種茶葉提取物活性成分含量以及清除自由基能力均存在一定差異。相關(guān)性分析顯示，茶葉提取物中茶黃素含量與羥基自由基清除能力呈顯著負(fù)相關(guān)，茶褐素以及茶色素含量與DPPH·自由基清除能力呈顯著負(fù)相關(guān)，茶多酚含量與超氧陰離子自由基清除能力呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.883、-0.934、-0.887以及0.945。

關(guān)鍵詞：茶葉；抗氧化；清除自由基；相關(guān)性分析

中圖分類號：TQ91 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3430-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.040

作為人體外源性抗氧化物質(zhì)的最重要來源，植物提取物的抗氧化研究開發(fā)日益受到重視[1]。自由基是指外層軌道含有未配對電子的原子、分子或基團(tuán)，是需氧生物生命活動過程中許多生物化學(xué)反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，自由基對機(jī)體的氧化損傷與有機(jī)體的多種疾病有關(guān)[2]。茶葉是天然抗氧化劑資源。近年來，研究者對不同品種茶葉中的黃酮、茶多酚、茶色素、茶多糖等活性成分的提取與抗氧化性能進(jìn)行了分析，特別是在清除自由基方面進(jìn)行了較多的研究[3-10]。本試驗(yàn)以5種茶葉為原料，比較5種茶葉乙醇提取物清除自由基的能力并探究其與茶黃酮、茶多酚、茶多糖等活性成分含量之間的相關(guān)性，以期為茶葉活性成分的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 茶葉：高級綠茶，產(chǎn)地江蘇無錫；明前毛尖，產(chǎn)地福建武夷山；名苑春芽，產(chǎn)地江蘇句容；碧螺春，產(chǎn)地杭州錢塘；金寨翠綠，產(chǎn)地安徽金寨，5種茶葉均為一級。

標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；乙醇、乙酸乙酯、碳酸氫鈉、苯酚、硫酸、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、草酸、葡萄糖、水楊酸、過氧化氫（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；10%福林酚試劑（分析純，上海荔達(dá)生物科技有限公司）；DPPH·自由基（分析純，北京中生瑞泰科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 電子天平：JA5003N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；分光光度計(jì)：WFJ7200型，尤尼柯（上海）儀器有限公司；微波萃取儀：MAS-2型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 采用微波輔助法提取茶多酚，稱取經(jīng)粉碎的茶葉約1 g，按料液比1∶35加入80%的乙醇溶液于微波專用的三頸燒瓶中，置于微波反應(yīng)器內(nèi)，調(diào)節(jié)微波時間3 min、微波溫度65 ℃、微波功率400 W進(jìn)行萃取。將萃取液趁熱過濾，3 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、真空干燥后得到乙醇提取物。

1.2.2 活性物質(zhì)測定

1）茶多酚含量的測定。提取物中茶多酚含量的測定參照Folin-Ciocalteu比色法[11]。765 nm處測定其吸光度，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中茶多酚的含量。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.016 5x+0.012，R2=0.998 0。

2）茶黃酮含量的測定。參照文獻(xiàn)[12]采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定總黃酮。420 nm波長處測定其吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中茶黃酮含量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=9.07x-0.004，R2=0.998 7。

3）茶紅素、茶黃素、茶褐素以及茶色素含量測定。茶色素測定按Roberts等[13]的方法略有修改。準(zhǔn)確稱取茶葉提取物0.2 g，用水溶解稀釋到100 mL。吸取稀釋液25 mL，加乙酸乙酯25 mL，振蕩后取乙酸乙酯萃取液2 mL，加入95%乙醇定容至25 mL得到a液。吸取乙酸乙酯萃取液15 mL，加入2.5% NaHCO3溶液15 mL，劇烈振蕩30 s后，吸取乙酸乙酯上層液4 mL，用95%乙醇定容至25 mL得到c液。吸取第一次水層待用液2 mL，加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL水，用95%乙醇定容至25 mL得到d液。再分別吸取25 mL稀釋液和25 mL正丁醇，振蕩后取水層2 mL，加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL水，用95%乙醇定容至25 mL得到b液。以95%乙醇做空白，在380 nm波長處分別測定各溶液的吸光度。

茶黃素含量=A×2.25/m×100%；茶紅素含量=（2Aa+2Ad-Ac-2Ab）×7.06/m×100%；茶褐素含量=7.06×2Ab/m×100%；茶色素含量=茶紅素+茶褐素+茶黃素。以上公式中，m為試樣質(zhì)量；Aa、Ab、Ac、Ad分別為溶液a、b、c、d的吸光度。

4）茶多糖含量的測定。采取苯酚硫酸法[14]測定。在490 nm處測定吸光度，并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品吸光度所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的茶多糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.361 8x-0.019 7，R2=0.996 6。

1.2.3 茶葉提取物自由基清除能力測定

1）DPPH·自由基清除率的測定：根據(jù)文獻(xiàn)[15]測定，結(jié)果以維生素C作陽性對照。

2）羥自由基清除率：參照文獻(xiàn)[14]測定，以維生素C作陽性對照，進(jìn)行對照試驗(yàn)[14]。計(jì)算清除率。

清除率=（[Ao-Ax-Axo）/Ao]×100%。

式中，Ao為對照組吸光度，Ax為多糖樣品吸光度，Axo為本底管吸光度。

3）超氧陰離子自由基清除率：超氧陰離子自由基清除率的測定采用鄰苯三酚法[16]。320 nm下測定相應(yīng)吸光度，結(jié)果以維生素C作陽性對照。

Sa=As-Ab/Ab×100%。

式中，Sa為自由基清除率；As為樣品吸光度；Ab為空白對照吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均平行測定3次，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0進(jìn)行相關(guān)性、顯著性以及擬合回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種茶葉乙醇提取物活性物質(zhì)含量的比較

圖1為5種茶葉乙醇提取物活性物質(zhì)含量測定結(jié)果。碧螺春乙醇提取物中黃酮含量最高，為0.183 4±0.020 mg/mL，金寨翠綠黃酮含量最低，為0.114 5±0.018 mg/mL，明前毛尖、名苑春芽、高級綠茶以及金寨翠綠這4種茶葉提取物黃酮含量差異不顯著；碧螺春和金寨翠綠提取物中茶多酚含量較高，均為7.85±0.020 mg/mL，高級綠茶茶多酚含量最低，為6.56±0.035 mg/mL；明前毛尖與碧螺春、明前毛尖與金寨翠綠、名苑春芽與金寨翠綠提取物中茶黃素含量差異不顯著；明前毛尖提取物茶褐素含量最高，為1.178±0.019 mg/mL，名苑春芽中茶褐素含量最低（0.160±0.023 mg/mL），但與高級綠茶、金寨翠綠茶褐素含量差異不顯著。名苑春芽和碧螺春、碧螺春和高級綠茶乙醇提取物中茶紅素含量差異不顯著；明前毛尖茶色素總含量最高（2.882±0.045 mg/mL），金寨翠綠茶色素總含量最低（1.704±0.012 mg/mL），但與名苑春芽差異不顯著，高級綠茶和碧螺春茶色素含量也無顯著差異。此外，名苑春芽和碧螺春乙醇提取物中茶多糖含量也無顯著差異。

2.2 5種茶葉乙醇提取物清除自由基能力分析

從表1可以看出，當(dāng)添加量為20 g/L時，5種茶葉乙醇提取物清除自由基能力均低于對照維生素C。碧螺春乙醇提取物羥基自由基和超氧陰離子清除率最高，而高級綠茶清除這兩種自由基清除能力均為最低。DPPH·自由基清除能力大小順序?yàn)楦呒壘G茶>金寨翠綠>名苑春芽>碧螺春>明前毛尖。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，5種茶葉提取物羥基自由基清除能力差異極顯著（P<0.01）。在清除DDPH·自由基方面，金寨翠綠與名苑春芽之間差異不顯著。在清除超氧陰離子方面，金寨翠綠與碧螺春差異不顯著。

利用SPSS19.0軟件對5種茶葉提取物在相同濃度下清除自由基的能力與黃酮、茶多酚、茶多糖等活性成分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出，茶黃素對茶葉乙醇提取物羥基自由基清除能力影響最大，茶紅素的影響最小，羥基自由基清除率與茶黃素含量顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.883；對DPPH·自由基清除率影響的大小順序?yàn)椴韬炙睾?gt;茶色素含量>茶黃素含量>茶紅素含量>茶多糖含量>黃酮含量>茶多酚含量，且與茶褐素以及茶色素含量顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為-0.934、-0.887；對超氧陰離子自由基清除能力的影響大小順序?yàn)椴瓒喾雍?gt;茶多糖含量>茶黃素含量>茶紅素含量>茶色素含量>黃酮含量>茶褐素含量，超氧陰離子自由基清除率與茶多酚含量顯著正相關(guān)（P<0.05）。

采用逐步回歸法消除多重共線性影響后，得到茶葉乙醇提取物清除自由基能力與活性物質(zhì)含量擬合的回歸方程（表3）。從表3可以看出，在羥基自由基清除率與茶黃素含量，DPPH·自由基清除率與茶褐素含量以及超氧陰離子自由基清除率與茶多酚含量之間建立的回歸模型顯著（P<0.05），R2在0.780～0.893之間，說明方程具有較高的擬合度。所得回歸方程分別為羥基自由基清除率=63.662-172.005×茶黃素含量（R2=0.780），DPPH·自由基清除率=80.809-11.631×茶褐素含量（R2=0.873），超氧自由基清除率=-174.880+30.487×茶黃素含量（R2=0.893）。

3 小結(jié)

利用不同的方法評價茶葉提取物抗氧化能力，結(jié)果有很大差異。生物體在進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的過程中伴有活性氧的產(chǎn)生，主要有超氧陰離子自由基、羥自由基等。由于不同活性物質(zhì)對自由基清除效果與機(jī)理不同，所以茶葉提取物清除自由基能力與茶多酚、黃酮等活性物質(zhì)含量之間的相關(guān)性存在差異。通過茶葉提取物中各主要活性成分與抗氧化性能相關(guān)分析，表明對茶葉提取物中的各種活性成分特別是以茶黃素、茶褐素為代表的茶色素類物質(zhì)的研究可以對茶葉提取物抗氧化性能有更加全面的理解，并且在評價抗氧化活性時，要綜合考慮，選擇更加合適的性能指標(biāo)。茶黃素、茶褐素和茶色素以及茶多酚對羥基自由基、DPPH·自由基、超氧陰離子自由基清除能力影響顯著，相關(guān)性分別為-0.883、-0.934、-0.887和0.945。

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