培養(yǎng)條件對蝙蝠蛾擬青霉菌株SH—1產生粉紅色變化的影響

摘要：冬蟲夏草[Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc.]菌培養(yǎng)過程中，蝙蝠蛾擬青霉菌株SH-1的菌絲產生粉紅色變化的現(xiàn)象，粉紅菌株與SH-1菌株形態(tài)上存在很大差異，為查明產生的原因，在單因素試驗基礎上考察培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、光照、pH和裝液量對粉紅色變化的影響，通過響應面法優(yōu)化冬蟲夏草真菌的培養(yǎng)環(huán)境，分析影響粉紅色變化的關鍵因素。結果表明，產生粉紅變化的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間80 d、培養(yǎng)溫度20.55 ℃、pH 7.51、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1產生概率為35.14%；得出菌株ZH-1的最大得率培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間80 d、培養(yǎng)溫度為22.25 ℃、pH 6.89、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1得率為8.95%。

關鍵詞：冬蟲夏草菌[Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc.]；響應面法；蝙蝠蛾擬青霉；培養(yǎng)條件；粉紅色變化

中圖分類號：S567.3+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3420-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.038

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc.]為真菌界（Fungi）子囊菌綱（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clvaieipiacteae）冬蟲夏草屬（Cordyceps）的蝙蝠蛾擬青霉寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，具有補肺益腎、止血化痰的功效，可用于久咳虛喘、陽痿遺精、腰膝酸痛的治療[1]。冬蟲夏草主要分布在中國青海、西藏、四川、甘肅等海拔3 000～5 000 m的地區(qū)，冬蟲夏草是主產區(qū)群眾經濟來源的重要組成部分[2]。近年來，冬蟲夏草被過度采挖，使冬蟲夏草野生資源瀕臨枯竭，野生冬蟲夏草生產面積正在逐年縮小，產量也隨之下降[3]。

冬蟲夏草菌無性型的分離與鑒定工作在多年以前就已進行[4，5]，分離到的冬蟲夏草真菌菌絲體是天然冬蟲夏草的替代品，其成分、含量與天然冬蟲夏草非常相似[6]。在靜止培育冬蟲夏草菌株SH-1的過程中，發(fā)現(xiàn)部分培養(yǎng)瓶內菌絲體生長到一定時期，從中間開始轉化成粉紅色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面變成有張力、有韌性的光滑表面，富含水分，周圍又形成多層毛刺狀結構。隨著生長瓶內培養(yǎng)物往往形成一個整體，周圍與瓶壁緊密結合，培養(yǎng)物顏色鮮艷，整體呈果凍狀，將產生變化后的粉紅色菌株編號為ZH-1。粉紅色變化影響了SH-1的正常生長，為了查明產生的原因和可能存在的相互關系，本試驗針對培養(yǎng)過程中與菌株生長有直接關系的培養(yǎng)基配方進行研究，利用響應面法分析配方組合對粉紅菌株產生的影響。Box-Behnken設計結合響應面法是通過多元線性擬合或二項式回歸分析來表達因素與響應值之間函數(shù)關系的一種統(tǒng)計方法[7，8]，可以明確任意兩個因素的交互作用，結果直觀、可靠，且試驗效果好[9]。

本研究在單因素試驗的基礎上選擇培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、pH、裝液量4個主要因素[10，11]，考察4個因素對粉紅菌株ZH-1產生的概率和得率、SH-1得率的影響，對影響粉紅菌株產生的概率和得率的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，以期找出適合粉紅菌株生長的最適培養(yǎng)條件，為下一步闡明兩個菌株之間的關系和探討產生的機理提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

供試菌種：冬蟲夏草菌由青海省畜牧獸醫(yī)科學院純化培養(yǎng)，編號為SH-1，經中國科學院微生物研究所鑒定為蝙蝠蛾擬青霉，保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器：組培瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、多功能光照培養(yǎng)箱、FA1004型電子分析天平。

分離用固體培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，自來水 1 000 mL，添加3 g牛肉膏。

培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基：每200 mL溶液中，土豆20 g、胡蘿卜10 g、氮源A 45 mL、氮源B 5 g、葡萄糖8 g、MgSO4為0.1 g、K2HPO4為0.4 g。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 冬蟲夏草菌液體培養(yǎng)條件：500 mL的培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液200 mL，接種量10 mL，pH 5.8，培養(yǎng)溫度20 ℃，光照條件為自然光照，培養(yǎng)時間60 d。單因素試驗每個處理134瓶，重復3次。響應面試驗每個處理20瓶，重復3次。

1.2.2 菌絲體生物量的測定 每個處理菌絲體在生長到60 d以后，收集已長成菌塊的菌絲體，用去離子水洗滌3次，60 ℃條件下干燥至恒重，即為菌絲體干重。

1.2.3 產生概率和得率的計算

概率=■×100%

得率=■×100%

式中，M為收取的菌絲體干重（g），V為平均裝液量（mL）。

1.2.4 單因素試驗和響應面法試驗設計 冬蟲夏草菌的培養(yǎng)過程中，影響粉紅菌株可能的因素有培養(yǎng)時間、光照條件、培養(yǎng)溫度、pH及裝液量，對這些條件進行單因素試驗。

1）培養(yǎng)時間對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定光照為自然光，溫度20 ℃，pH 5.8，裝液量200 mL，選擇培養(yǎng)時間為20、40、60、80、100 d 進行試驗。

2）光照條件對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時間為60 d，溫度20 ℃，pH 5.8，裝液量200 mL，選擇光照條件為無光照、自然光照、全日光照進行試驗。

3）培養(yǎng)溫度對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時間為60 d，光照條件為自然光照，pH 5.8，裝液量200 mL，選擇培養(yǎng)溫度為5、10、15、20、25、30 ℃進行試驗。

4）pH對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時間為60 d，光照條件為自然光照，培養(yǎng)溫度20 ℃，裝液量200 mL，選擇pH為4、5、6、7、8、9、10進行試驗。

5）裝液量對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時間為60 d，光照條件為自然光照，培養(yǎng)溫度20 ℃，pH 5.8，選擇裝液量為100、150、200、250、300 mL進行試驗。

應用 Design-expert 8.0軟件，設計4因素3水平的響應面試驗，利用響應面試驗結果，確定產生粉紅變化的最適培養(yǎng)條件以及影響粉紅菌株ZH-1得率的最適培養(yǎng)條件。試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 冬蟲夏草菌培養(yǎng)條件單因素試驗結果

2.1.1 培養(yǎng)時間對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖1可知，培養(yǎng)時間為60 d時SH-1產生ZH-1的變化概率最大。圖2顯示，隨著時間的增加，菌株SH-1和ZH-1的得率也在增加，60 d后兩個株菌得率的增長趨勢變緩，考慮到培養(yǎng)效率與成本，培養(yǎng)時間選擇60 d為宜。培養(yǎng)過程中，SH-1產生ZH-1的變化概率由18.66%下降為13.43%，部分ZH-1在沒有完全覆蓋原來的菌蓋之前，又從邊緣開始變白，重新生成正常菌絲，因此，ZH-1的數(shù)量隨時間的增長而下降。

2.1.2 光照條件對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖3可知，光照條件對菌株SH-1產生ZH-1的變化概率影響不大。圖4顯示，隨著光照條件的改變，菌株SH-1和ZH-1的得率沒有顯著變化，因此，選擇光照條件為自然光照。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖5可知，不同培養(yǎng)溫度對菌株SH-1產生ZH-1的變化概率影響較大，在25 ℃時，變化概率最大。圖6顯示，低溫（小于10 ℃）時沒有產生粉紅菌株ZH-1，隨著溫度的進一步升高，菌株SH-1和ZH-1的得率呈先增加后降低的趨勢，但ZH-1的得率變化不顯著，因此，選擇培養(yǎng)溫度20 ℃為宜。

2.1.4 pH對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖7可知，pH為7時菌株SH-1產生ZH-1的變化概率最大。圖8顯示，在pH為7時菌株ZH-1的得率產生最大值，而菌株SH-1的得率在pH為6時產生最大值。在pH為4和8時，沒有菌株ZH-1出現(xiàn)，說明pH對菌株SH-1產生ZH-1的變化概率影響較大，因此選擇pH 7為宜。

2.1.5 裝液量對產生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖9可知，裝液量為300 mL時菌株SH-1產生ZH-1的變化概率最大。圖10顯示，菌株ZH-1與SH-1的得率隨著裝液量的增加而增加，得率最大值都產生在裝液量為300 mL時，說明裝液量對粉紅菌株ZH-1的產生和得率都有影響。

2.2 響應面法試驗結果

通過單因素試驗分析，篩選出培養(yǎng)時間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、pH（X3）、裝液量（X4）4個主要因素，采用Box-Behnken設計結合響應面法，以菌株SH-1產生菌株ZH-1的概率（Y1）和ZH-1的得率（Y2）為響應值，考察影響產生粉紅菌株的培養(yǎng)條件，試驗結果見表2。

根據(jù)表3中回歸模型的方差分析可知，模型1的F=5.862 1，P<0.01，模型2的F=166.352 7，P<0.000 1，說明本試驗所選用的二次多項式模型具有高度的顯著性。模型1的失擬項F=4.722 2，P=0.074 0>0.05，模型2的失擬項F=4.705 8，P=0.074 5>0.05，失擬項均不顯著，2個模型的決定系數(shù)R2值分別為0.854 3和0.994 0，說明2個模型能夠解釋85.43%和99.40%的響應值變化。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預測菌株ZH-1的產生概率和得率。在總的作用因素中，回歸方程一次項X1、X2、X4對菌株ZH-1產生概率的影響達到顯著或極顯著水平；回歸方程一次項X1、X2、X4，二次項X12、X22、X32和交互項X1X2、X1X3、X1X4、X2X4對菌株ZH-1得率的影響達到顯著或極顯著水平，由F值的大小可以推斷3個因素影響菌株ZH-1得率（Y2）的大小順序為X4>X2>X1。

試驗所選用的4個因素，不僅影響到菌株SH-1產生菌株ZH-1的概率，而且對粉紅菌株ZH-1得率有影響。分別以Y1、Y2為響應值，以X1、X2、X3、X4為因變量，通過擬合可求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到產生粉紅菌株ZH-1的概率和ZH-1得率的二次方程（表4）。

2.3 因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制菌株ZH-1產生概率和得率響應面三維圖與等高線，可直觀地看出響應面的最高點，即參數(shù)范圍內的極值以及因素間的相互作用對響應值的影響，依次可以確定最適培養(yǎng)基配方條件范圍，采用Design-expert 8.0軟件處理后三維響應面和等高線見圖11、圖12。

分析可知，培養(yǎng)溫度（X2）對菌株SH-1產生ZH-1的概率影響極顯著，培養(yǎng)時間（X1）與裝液量（X4）對菌株SH-1產生ZH-1的概率影響顯著。培養(yǎng)時間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）與裝液量（X4）對粉紅菌株ZH-1的得率有極顯著影響，表現(xiàn)為曲線較陡，即隨著元素含量的增加或減少，響應值變化較大；其他項影響較小，表現(xiàn)為曲線較為平滑。交互項影響中，對于粉紅菌株ZH-1的產生概率，交互作用不顯著。培養(yǎng)時間（X1）與培養(yǎng)溫度（X2）、培養(yǎng)時間（X1）與pH（X3）、培養(yǎng)時間（X1）與裝液量（X4）、pH（X3）與裝液量（X4）對菌株ZH-1得率有顯著的交互作用。

2.4 菌株ZH-1產生概率及得率的最適配方

確定通過軟件Design-expert 8.0求解方程，得出發(fā)生粉紅變化產生菌株ZH-1的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間80 d、培養(yǎng)溫度20.55 ℃、pH 7.51、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1產生概率為35.14%；得出ZH-1的最大得率培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間80 d、培養(yǎng)溫度22.25 ℃、pH 6.89、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1得率為8.95%。

3 小結

本研究以冬蟲夏草菌菌絲體生物量為量化指標，從培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、光照條件、pH、裝液量5個因素進行單因素試驗，在此基礎上通過響應面法試驗，建立了培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、pH、裝液量4個因素與冬蟲夏草粉紅菌株產生概率之間的數(shù)學模型，研究采用響應面法確定環(huán)境因素影響粉紅菌株產生的可行性[12]。試驗表明，模型的回歸效果顯著，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間與產生粉紅菌株有直接關系，可作為預測粉紅菌株產生的參考因子，4個因素的交互作用對產生粉紅菌株ZH-1和ZH-1得率有一定的影響。試驗確定了產生粉紅菌株ZH-1最適的培養(yǎng)條件和獲得ZH-1最大得率的培養(yǎng)條件。

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