熱水法提取香菇多糖和茶樹菇多糖研究

摘要：真菌多糖具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，且對機體毒副作用小，具有廣闊的開發(fā)前景。以營養(yǎng)價值和藥用價值均較高的香菇（Lentinus edodes）、茶樹菇（Agrocybe aegirit）為原料，用熱水提取法在90 ℃、料液比1∶20（g∶mL）、提取1次、4 h的條件下，提取兩種真菌多糖。結(jié)果表明，熱水法提取香菇多糖的得率為9.70%，茶樹菇多糖的得率為13.10%，說明茶樹菇中的多糖含量高于香菇。該研究可為后續(xù)開發(fā)利用真菌多糖提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：香菇（Lentinus edodes）；茶樹菇（Agrocybe aegirit）；多糖；熱水提取法

中圖分類號：S646.1+2；S646.9 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4258-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.047

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體和發(fā)酵液中分離出的一種活性物質(zhì)。真菌多糖具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗突變、抗衰老和抗炎等多種生理功能[1]。在一些食用菌中含有多種真菌多糖，如香菇（Lentinus edodes）、茶樹菇（Agrocybe aegirit）、猴頭菇（Hericium erinaceus）等。香菇多糖一級結(jié)構(gòu)的主鏈為β-（1，3）-D-葡聚糖，在主鏈的C6位上含有支點（每5個葡萄糖有2個支點），其支鏈由β-（1，6）鍵和β-（1，3）鍵相連的葡聚糖組成，在支鏈上也含有少數(shù)內(nèi)部β-（1，6）鍵[2]。目前，在醫(yī)藥和保健品行業(yè)，香菇多糖產(chǎn)品具有極大的市場前景。茶樹菇多糖的含量很高，可達干重的30%～40%，主要成分為α-（1，3）-D-葡聚糖，還含有甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖及阿拉伯糖等[3]。其藥理作用十分廣泛，是一種極具開發(fā)前景的真菌多糖。20世紀(jì)60年代以后，隨著真菌多糖生物活性不斷被發(fā)掘，越來越多的真菌多糖產(chǎn)品被開發(fā)，應(yīng)用于保健品和醫(yī)藥行業(yè)。

目前，國內(nèi)外已從近300種真菌中分離出200多種有生物活性的多糖物質(zhì)[4]。專家預(yù)言，21世紀(jì)將是多糖的時代。顯然，如何提高真菌多糖的得率和品質(zhì)已成為首要解決的問題。

現(xiàn)在常用的提取真菌多糖的方法有：熱水提取法、酸提法、堿提法、酶法等。酸、堿提法雖耗時短，提高了多糖得率，但易破壞多糖結(jié)構(gòu)；酶法反應(yīng)條件溫和，但較難控制試驗條件，對操作要求高。而熱水提取法因操作簡單、有機溶劑使用量少、對多糖的生物活性破壞小和試驗成本低，成為目前提取真菌多糖最常用的方法。熱水法提取真菌多糖時，原料的粉碎程度、提取溫度、時間、次數(shù)、料液比以及醇析時乙醇添加倍數(shù)都可能影響多糖得率。蘇紅等[5]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)原料粉碎度達到70目以上時，粉碎度對多糖提取率的影響較小，且粉碎度過高反而會降低多糖得率。真菌多糖的提取率常隨溫度的升高而增大，但溫度太高則會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，所以提取溫度常據(jù)經(jīng)驗和試驗條件控制在90 ℃左右[5]。一般而言，真菌多糖的最佳提取時間在3 h以上，且時間越長，多糖得率越高，但超過一定時間，多糖得率升高不明顯。李浩飛等[6]在研究樺褐孔菌多糖的水提工藝時，得出結(jié)論：當(dāng)料液比為1∶5、1∶10、1∶20 （g∶mL，下同）時，提取次數(shù)這一因素影響不大，且提取1次即可。目前，國內(nèi)許多學(xué)者對熱水提取法的工藝進行了研究和優(yōu)化，得到的結(jié)果一般是提取溫度90～100 ℃，提取2～4 h。

因此，在充分研究熱水提取法對多糖得率的影響因素和條件設(shè)置基礎(chǔ)上，該研究通過熱水提取法對香菇多糖和茶樹菇多糖進行了提取，并比較兩者的多糖得率，進而比較香菇和茶樹菇中多糖含量，以期指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)選取合適的原材料，來獲得較高的多糖產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇、干茶樹菇、葡萄糖、蒸餾水、乙醇（密度0.79 g/mL）、氯仿、正戊醇、濃硫酸、苯酚（除硫酸為優(yōu)級純外，其他試劑均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

202型電熱恒溫干燥箱、LFP-2500A型高速多功能粉碎機、722S型可見光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；TD5-Ⅱ型低速多管架自動平衡離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（上海青浦滬西儀器廠）；HH-42型數(shù)顯恒溫三用水箱。

250 mL錐形瓶、玻璃棒、500 mL抽濾瓶、電子天平、藥匙、稱量紙、濾紙、布氏漏斗、剪刀、容量瓶、量筒、試管、試管架、膠頭滴管、移液槍、槍頭、比色皿、15 mL EP管、20目篩子。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 105 ℃干燥葡萄糖至恒重，稱取100.0 mg，加蒸餾水溶解后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，配成濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。吸取已配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于6個50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，搖勻。準(zhǔn)確吸取2 mL，分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖5 min，置沸水中加熱15 min，然后于冷水浴中冷卻30 min，以溶劑蒸餾水為空白作對照。

在490 nm條件下，測吸光度，記錄數(shù)據(jù)。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度X（mg/mL）與吸光度Y的回歸方程。

1.3.2 粗多糖的提取 將干香菇或干茶樹菇粉碎，用20目的篩子篩取同樣大小的粉末。稱取粉末5.0 g，倒入250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水100 mL，混合均勻后置于90 ℃恒溫水浴鍋中，每隔15 min用玻璃棒攪拌數(shù)次，水浴4 h后結(jié)束，冷卻至室溫。

減壓抽濾，收集濾液并記錄其體積。取濾液 2 mL于15 mL EP管中，加6 mL無水乙醇，3 000 r/min離心10 min后，傾去上清液；再加6 mL 80%乙醇，同樣條件離心5 min，重復(fù)2次，將沉淀于60 ℃烘干，得多糖粗品。

1.3.3 脫蛋白 將多糖粗品用水溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。接著吸取定容液3 mL分別稀釋0、10、20、30倍，并對應(yīng)編號，取稀釋液3 mL于EP管中，加入3 mL的氯仿-正戊醇（體積比為 4∶1）混合試劑，充分振搖5 min，3 500 r/min離心15 min，取上清。重復(fù)上述操作共3次。

1.3.4 多糖的測定 分別吸取2 mL上清液于試管中，各加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖5 min，置沸水浴中加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻30 min，以溶劑蒸餾水為空白作對照。 在490 nm處測吸光度，記錄數(shù)值。

確定多糖測定的稀釋倍數(shù)后，按上述試驗過程操作測多糖得率（粗多糖定容后，只需稀釋至已確定的倍數(shù)）。一次試驗平行測3組數(shù)據(jù)。

多糖得率=[（多糖濃度×稀釋倍數(shù)×濾液體積）/（2×5×1 000）]×100% （數(shù)字2代表試驗中吸取的 2 mL濾液，5代表原料質(zhì)量5 g，1 000代表質(zhì)量單位g換算成mg，稀釋倍數(shù)為1 000倍）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度X（mg/mL）與吸光度Y的回歸方程：Y=16.021X，R2=0.993 6。

2.2 多糖稀釋倍數(shù)的確定

由表1中可知，將2 mL茶樹菇濾液中的多糖稀釋100倍，吸光度大于1，數(shù)值不可信；稀釋1 000倍所測的數(shù)值比稀釋2 000倍、3 000倍更接近數(shù)值0.5，測得數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。所以，確定測定多糖前需將 2 mL濾液中多糖稀釋1 000倍。

2.3 茶樹菇多糖和香菇多糖得率的計算

稱取5 g茶樹菇粉末和5 g香菇粉末，各加入100 mL蒸餾水溶解，經(jīng)熱水提取法提取多糖后進行減壓抽濾，分別得到的濾液體積為80、58 mL。分別取2 mL濾液進行后續(xù)的多糖純化。由表2可知，測得茶樹菇多糖吸光度的平均值為0.263（試管4中測得的茶樹菇多糖的吸光度誤差較大，故舍去），測得香菇多糖吸光度的平均值為0.267。將多糖的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其濃度，最后根據(jù)下式計算多糖的得率。最終得出熱水法提取的茶樹菇多糖得率為13.10%，香菇多糖得率為9.70%。預(yù)估茶樹菇中的多糖含量高于香菇。

3 討論

對于熱水法提取香菇多糖的研究，謝紅旗[7]在試驗中發(fā)現(xiàn)，最佳工藝參數(shù)為料液比1∶20，溫度95 ℃，提取4 h；此時多糖的提取率為4.68%。王衛(wèi)國等[8]在對香菇多糖的熱水提取法進行優(yōu)化研究中得出，香菇多糖提取的最佳條件為料液比1∶20，溫度96 ℃，提取4 h，多糖得率為6.50%。曾智平[9]確定了傳統(tǒng)熱水法提取香菇多糖最優(yōu)條件為料液比1∶20，溫度90 ℃，提取3 h，多糖得率為9.97%。

對茶樹菇多糖的熱水法提取工藝，趙艷[1]通過響應(yīng)面法進行了優(yōu)化，最終得到的最佳提取條件為料液比1∶50、溫度95 ℃、提取4 h。在這種方法下，多糖得率為3.10%。陳發(fā)河等[10]研究發(fā)現(xiàn)，提取茶樹菇多糖的最適條件為料液比1∶20、溫度70 ℃、提取時間 3 h。茶樹菇多糖的平均得率為3.85%。廖丹葵等[11]采用正交試驗考察了熱水法提取茶樹菇多糖的工藝，在料液比1∶20、溫度為90 ℃和提取4 h，3次共12 h條件下，茶樹菇多糖得率最高為6.13%。

由上述分析可知，研究者們確定的提取香菇多糖、茶樹菇多糖的料液比的最佳條件大都為1∶20；而在90 ℃條件下，二者的提取率均為最高，因而90 ℃為最適溫度。一般而言，真菌多糖的最佳提取時間在3 h以上，且在一定范圍內(nèi)，時間越長，多糖得率越高，所以本試驗提取時間設(shè)置為4 h。李浩飛等[6]在研究樺褐孔菌多糖的水提工藝時，得出結(jié)論：當(dāng)料液比為1∶20時，提取次數(shù)這一因素影響不大，提取1次即可。綜合考慮各因素后，本試驗將熱水提取法的條件設(shè)置為：料液比1∶20、溫度90 ℃、提取1次、提取時間4 h。

經(jīng)乙醇沉淀得到的粗多糖，尚有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的存在，必須除去。研究表明，Sevag法是目前最溫和的除蛋白質(zhì)方法[12]。多糖中的蛋白質(zhì)含量會隨著脫蛋白次數(shù)的增加而減少，經(jīng)6次脫除處理后，多糖中的蛋白質(zhì)幾乎可全部除去。但在此過程中，每脫除一次蛋白，會損失部分多糖。且脫除處理超過3次后，蛋白質(zhì)含量減少的幅度明顯減緩；而前3次脫除的蛋白質(zhì)的量可占脫除蛋白質(zhì)總量的87.7%[13]?？紤]到既要盡可能多的脫除蛋白，又要減少多糖的損失，本試驗脫除蛋白最終采用了Sevag法，共3次。

在多糖測定的方法學(xué)研究中，于村等[14]以香菇為原料比較了直接滴定法、蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法這三種常見方法。結(jié)果表明，直接滴定法的靈敏度較低，蒽酮-硫酸法測得的多糖含量過高，苯酚-硫酸法的準(zhǔn)確性最好，是測定多糖含量最理想的方法。因而，本試驗選擇了苯酚-硫酸法測定多糖。

綜上所述，試驗中每一步驟的設(shè)置，從熱水法提取粗多糖、蛋白質(zhì)的去除到多糖的測定，均采用了目前研究認(rèn)定的最佳條件。所以，本試驗方案具有系統(tǒng)性、科學(xué)性以及可行性。

本試驗用熱水法在90 ℃、料液比為1∶20、提取1次、4 h的條件下提取香菇多糖和茶樹菇多糖，通過計算得出香菇多糖得率為9.70%，茶樹菇多糖得率為13.10%。說明了茶樹菇中的多糖含量高于香菇。該結(jié)果為后續(xù)多糖物質(zhì)的提取利用提供了重要依據(jù)。

目前，國內(nèi)外對真菌多糖生物活性的研究取得了驕人的成績，現(xiàn)已利用其抗病毒、抗癌等活性制備出各類新藥、保健品及功能食品等，但對于真菌多糖的高級結(jié)構(gòu)及其作用機制，以及多糖的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，還知之甚少。因此，在今后的工作中，應(yīng)加強這些方面的研究。

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