響應(yīng)面法對香椿葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化

摘要：為了提高香椿（Toona Sinensis）葉總黃酮的純化效率，試驗以鄂東地區(qū)野生香椿為材料，采用響應(yīng)面法建立了H-107大孔樹脂對香椿葉中黃酮動態(tài)吸附和解吸的二次多項數(shù)學(xué)模型，并驗證了模型的有效性。結(jié)果表明，H-107大孔樹脂對香椿葉總黃酮動態(tài)吸附參數(shù)為上樣液濃度1.60 mg/mL、上樣液流速0.5 mL/min、上樣液pH 5.0。H-107大孔樹脂的最優(yōu)動態(tài)吸附率驗證值為98.7%（理論值為99.1%）；H-107大孔樹脂對香椿葉中黃酮動態(tài)解吸率的工藝參數(shù)為解吸液體積分數(shù)64.88%、解吸液流速0.91 mL/min、解吸液體積99.11 mL、H-107大孔樹脂的最優(yōu)動態(tài)解吸率驗證值為87.21%（理論值為88.45%）。上述結(jié)果表明，H-107大孔樹脂對香椿葉中總黃酮有較好的吸附解吸性能。

關(guān)鍵詞：香椿（Toona Sinensis）；總黃酮；響應(yīng)面法；吸附；解吸

中圖分類號：S644.4；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4253-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.046

香椿（Toona sinensis）又名香椿芽、香樁頭、椿天等，屬楝科，原產(chǎn)于中國，廣泛分布于長江南北平源地區(qū)和大別山區(qū)[1，2]。香椿中黃酮類物質(zhì)含量較高，黃酮類化合物具有心血管系統(tǒng)活性、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎等多種生物活性[3，4]。目前已有多種方法從香椿葉中提取并純化黃酮類化合物，這些方法包括堿浸酸沉法[5]、酶解法[6]、超臨界CO2流體萃取法[7]、薄層析法[8]等。大孔樹脂是一類有機高分子聚合物吸附劑，具有吸附量大、選擇性好、可重復(fù)使用等優(yōu)點，已廣泛用于生物活性物質(zhì)的分離純化[9]。目前采用響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹脂純化香椿葉中總黃酮的研究報道較少。本研究以H-107大孔樹脂為吸附載體，采用響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉總黃酮的提取純化工藝，為進一步開發(fā)利用香椿葉總黃酮資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香椿葉采自湖北省麻城市木子店鎮(zhèn)，于2014年6月上旬采集。

蘆?。兌葹?9.9%）購自四川光泰制藥有限公司；H-107樹脂（非極性）購自鄭州亨通化工；NaCl、NaOH、NaNO2、Al（NO3）3、石油醚、環(huán)己烷、無水乙醇均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樹脂預(yù)處理 將H-107樹脂完全浸入乙醇中，并不斷攪拌，以除去氣泡，靜置24 h后將樹脂裝入1.5 cm×50.0 cm玻璃層析柱中，用2倍體積的乙醇以3.0 mL/min的流速沖洗樹脂，至洗脫液無白色渾濁物，再用蒸餾水以同樣流速沖洗樹脂至無醇，完全洗脫后，先酸洗再堿洗，即先用2倍體積1.0 mol/L的鹽酸浸泡，同時沖洗樹脂，流速為6.0 mL/min，再以同樣流速的蒸餾水沖洗至中性，然后以2倍體積的1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，最后按同樣的流速用蒸餾水沖洗至中性備用。

1.2.2 香椿葉總黃酮的粗提 稱取新鮮采集的香椿葉500 g于55 ℃恒溫箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩后用濾紙將香椿葉包好放入索氏抽提器中，在圓底燒瓶中加入300 mL石油醚，70 ℃脫脂6 h后，再將香椿葉烘干至恒重。稱取上述香椿葉5.0 g研磨成粉末樣品，以70%乙醇水溶液，于200 W功率下超聲處理30 min后，于70 ℃抽提兩次，每次1.5 h，料液比為1∶20（g∶mL，下同），合并兩次提取液。采用乙醇沉淀法除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)[10]，減壓回收乙醇，將濃縮液轉(zhuǎn)入水相用環(huán)己烷除去葉綠素，得到總黃酮粗提取液。

1.2.3 H-107大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸 準確稱取經(jīng)預(yù)處理后的H-107樹脂10.0 g，瀝干水分，濕法裝入1.5 cm×50.0 cm玻璃層析柱中。將10.0 mL總黃酮粗提液緩慢倒入層析柱，進行動態(tài)吸附直至樣品全部流出為止。再用20.0 mL超純水洗去可溶性多糖及雜質(zhì)，最后用一定體積分數(shù)的乙醇溶液進行洗脫[11]。按下述公式分別計算動態(tài)吸附率和解吸率：

吸附率=（C0-CV）/C0×100%；

解吸率=C3V2/[（C0-C1）V0-C2V1]×100%

式中，CV為吸附后溶液中總黃酮濃度；C0為吸附前溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為除雜用水中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C3為解吸液中黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為供試總黃酮提取液體積，mL；V1為除雜用水體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.2.4 動態(tài)吸附和動態(tài)解吸條件 在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，將上樣液速率、濃度、pH作為影響動態(tài)吸附率的3個主要因素，每個因素設(shè)3個水平，試驗因素與水平見表1；將洗脫液流速、體積、體積分數(shù)作為影響動態(tài)解吸率的3個主要因素，每個因素設(shè)3個水平，試驗因素與水平見表2。借助DX8Trial軟件中響應(yīng)面曲面法Box-Behnken設(shè)計，各產(chǎn)生17組試驗，所得試驗數(shù)據(jù)均采用DX8Trial軟件內(nèi)部程序進行回歸分析和方差分析。

1.2.5 總黃酮濃度的測定

1）標準曲線的測定。以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[12]。稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.01 g，于60 ℃水浴中溶于70%乙醇，并定容至100 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL蘆丁標準溶液。分別取上述標準液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6支試管中，加入0.3 mL 5% NaNO3溶液搖勻，靜置6 min后再加入適量10% Al（NO3）3溶液搖勻，靜置6 min后加入4% NaOH溶液搖勻，最后加70%乙醇定容至10.0 mL，靜置15 min后采用分光光度法測510 nm處吸光度。以吸光度Y對蘆丁濃度X繪制標準曲線（圖1），回歸方程為Y=10.581 3X+0.002 47（R2=0.999 7），其中X為蘆丁濃度（mg/mL），Y為吸光度。

2）提取液中總黃酮濃度的測定。取香椿葉總黃酮提取液1.0 mL，按上述方法測定510 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線求出提取液中總黃酮的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 香椿葉總黃酮的粗提

試驗采用單一溶劑提取，粗提液中總黃酮濃度為1.21 mg/mL，總黃酮提取率為4.7%，后采用超聲波輔助提取，粗提液中總黃酮濃度為1.47 mg/mL，提取率為5.7%（圖2）。采用超聲波輔助提取的提取率較單一溶劑的提取率提高約21.28%。

2.2 動態(tài)吸附的響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)DX8Trial軟件中的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取影響H-107大孔樹脂動態(tài)吸附總黃酮的主要因素（上樣液濃度、上樣液流速、上樣液pH）進行3因素3水平試驗，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化香椿葉中總黃酮純化工藝參數(shù)。根據(jù)表3數(shù)據(jù)建立二次回歸方程?；貧w方程為：吸附率=44.49+17.82A+26.12B+10.93C+1.16AB-1.13AC-5.55BC-3.97A2-5.82B2-0.32C2。模型顯著檢驗P<0.05，表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，由表4中方差分析可知，自變量一次項A、B、C和二次項AB、AC、BC、A2、B2顯著性檢驗值P<0.05。失擬項P=0.859 1>0.05，無失擬因素存在，表明該模型真實可行。

圖3直觀的反應(yīng)了各因素交互作用對動態(tài)吸附率的影響，曲線越陡峭，等高線越密集，表明該因素的變化對動態(tài)吸附率的影響越大。從圖3a可以看出，與上樣液濃度曲面相比，上樣液流速曲面比較陡峭，說明上樣液流速對動態(tài)吸附率的影響較大。從圖3b可以看出，上樣液濃度曲面陡峭，而上樣液pH曲面比較平緩，說明與上樣液pH相比，上樣液濃度對動態(tài)吸附率的影響較大。從圖3c可以看出，上樣液流速方向等高線比較密集，說明上樣液流速對動態(tài)吸附率的影響比上樣液pH大。通過軟件分析確定的樹脂最優(yōu)動態(tài)吸附條件為：上樣液濃度1.60 mg/mL，上樣液流速0.5 mL/min，上樣液pH 5.0，H-107大孔樹脂的最優(yōu)動態(tài)吸附率為98.7%（理論值為99.11%）。

2.3 動態(tài)解吸的響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)DX8Trial軟件中的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取影響H-107大孔樹脂動態(tài)解吸的主要因素（解吸液體積分數(shù)、解吸液體積、解吸液流速）進行3因素3水平中心組合試驗，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化香椿葉中總黃酮純化工藝參數(shù)。根據(jù)表5數(shù)據(jù)建立二次回歸方程?；貧w方程為：解吸率=-161.95+4.53E+32.36F+1.79D-0.01EF-0.004DE-0.09DF-0.03E2-12.22F2-0.007D2

從表5中可知，當洗脫液體積為100 mL、洗脫液體積分數(shù)為70%、洗脫液流速為1.0 mL/min時，H-107大孔樹脂對黃酮的解吸率達到最大88.06%，當洗脫條件相同時，解吸率相差不明顯，說明試驗操作引起的誤差較小。模型顯著檢驗P<0.05，表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，由表6中方差分析可知，自變量一次項D、E、F和二次項DE、DF、D2、E2、F2顯著P<0.05。失擬項P值為0.316 3>0.05，無失擬因素存在，表明該模型真實可行。由P值可以看出影響H-107大孔樹脂動態(tài)解吸率的因素為：體積分數(shù)>流速>體積。

圖4綜合反映了各因素的交互作用對動態(tài)解吸率的影響。從圖4a可以看出，解吸液體積分數(shù)方向上響應(yīng)曲面比較陡峭且等高線密集，說明與解吸液流速相比解吸液體積分數(shù)對H-107樹脂動態(tài)解吸的影響較大。從圖4b可以看出，與解吸液體積相比解吸液體積分數(shù)方向上的曲面圖更加陡峭且等高線密集，說明解吸液體積分數(shù)對H-107樹脂動態(tài)解吸的影響較大。從圖4c可以看出，與解吸液體積相比解吸液流速方向上曲面更加陡峭且等高線密集，說明解吸液流速對H-107樹脂動態(tài)解吸的影響較大。

由回歸方程確定的最優(yōu)動態(tài)解吸率條件為：解吸液體積分數(shù)64.88%，解吸液流速0.91 mL/min，解吸液體積99.11 mL，H-107樹脂的最優(yōu)動態(tài)解吸率為87.21%（理論值為88.45%）。

3 小結(jié)與討論

本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化了香椿葉總黃酮提取純化工藝，克服了單因素及正交設(shè)計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區(qū)域上各影響因素最佳組合和找出最優(yōu)響應(yīng)值的缺陷[13]，從而為香椿葉中總黃酮的提取純化提供了更加有效的辦法，減少了試驗誤差，提高了純化效率。

試驗采用響應(yīng)曲面法建立H-107大孔樹脂吸附香椿葉總黃酮的動態(tài)吸附和動態(tài)解吸的二次多項數(shù)學(xué)模型，并通過利用DX8Trial軟件進行分析，同時利用模型的響應(yīng)面對影響香椿葉中總黃酮吸附特性的關(guān)鍵因素及相互作用進行探討，得到H-107大孔樹脂對香椿葉中總黃酮動態(tài)吸附的工藝參數(shù)為：上樣液濃度1.60 mg/mL，上樣液流速0.5 mL/min，上樣液pH 5.0，H-107大孔樹脂的最優(yōu)動態(tài)吸附率驗證值為98.7%（理論值為99.11%）；H-107大孔樹脂對香椿葉黃酮動態(tài)解吸率的工藝參數(shù)為：解吸液體積分數(shù)64.88%，解吸液流速0.91 mL/min，解吸液體積99.11 mL，H-107樹脂的最優(yōu)動態(tài)解吸率為87.21%（理論值為88.45%）。樹脂的動態(tài)吸附率達到85%以上，解吸率達80%以上。同此前報道的ADS-17大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附率為70.16%，解吸率為71.12%[14]相比，H-107大孔樹脂表現(xiàn)出對香椿葉總黃酮良好的吸附和解吸特性，并可用于科學(xué)研究和實際生產(chǎn)中香椿葉總黃酮的提取純化。

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