飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦成活率和肝胰腺三種免疫酶的影響

摘要：采用不同密度（12、20、32、40、52、60尾/m2）飼養(yǎng)克氏原螯蝦（Procambarus clarkill）[體重（2.4±0.2） g]2個月，分別計算其相對生長率、成活率、附肢完整率，測定其肝胰腺中酸性磷酸酶（ACP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）活性，旨在了解飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長、成活和抗病力的影響，尋找此規(guī)格克氏原螯蝦適宜的養(yǎng)殖密度。結果表明，隨著飼養(yǎng)密度的增加，克氏原螯蝦的生長率、成活率、附肢完整率及肝胰腺的ACP、T-SOD、LZM活性均顯著下降?？紤]到既要能充分利用水體資源又要獲得最大的生長率和成活率，綜合分析后認為，20尾/m2的飼養(yǎng)密度為此規(guī)格克氏原螯蝦適宜的飼養(yǎng)密度。

關鍵詞：飼養(yǎng)密度；克氏原螯蝦（Procambarus clarkill）；成活率；免疫酶

中圖分類號：S963.73；S966.12 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4237-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.042

養(yǎng)殖密度是影響水體生產力的重要因素。養(yǎng)殖者為了充分利用水體資源獲得更大的產量，往往進行高密度養(yǎng)殖。然而，養(yǎng)殖密度不僅是影響?zhàn)B殖容量的主要因素，還與水生生物的生長和存活率有密切聯系。鄧夢穎等[1]研究了養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦（Procambarus clarkill）幼蝦生長、攝食和餌料利用的影響，結果表明，隨著飼養(yǎng)密度的增加，克氏原螯蝦幼蝦的體長、特定生長率、平均日增重、成活率和蛻殼率都隨之減小且降幅明顯；飼料利用方面，平均攝食量和攝食率均與養(yǎng)殖密度呈反比，蛋白質特定生長率和脂肪儲積率隨養(yǎng)殖密度增大呈減小趨勢。肖鳴鶴等[2]研究了養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦幼蝦生長、消化酶活力和生理生化指標的影響，結果表明，高密度養(yǎng)殖對克氏原螯蝦幼蝦生長和消化酶活力具有一定的負面影響，并隨著養(yǎng)殖密度的增大，克氏原螯蝦幼蝦肌肉中葡萄糖的含量呈下降趨勢，甘油三酯、總蛋白質、尿素氮和膽固醇含量呈不斷增多的趨勢，肝胰腺葡萄糖、甘油三酯、總蛋白質和尿素氮含量隨養(yǎng)殖密度的增大也呈不斷增多的趨勢。本試驗旨在研究養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦體內免疫相關酶的影響，以期探討高密度養(yǎng)殖條件下克氏原螯蝦死亡率高的原因和機制以及較為適宜的養(yǎng)殖密度。

1 材料與方法

1.1 材料

克氏原螯蝦幼蝦購自南京高淳縣水產養(yǎng)殖公司；試驗飼料原料購自南京市水產研究所養(yǎng)殖實驗基地。

酸性磷酸酶（ACP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗是在南京曉莊學院生態(tài)學省級重點建設學科水產動物生理生態(tài)研究室內的18個水族箱中進行的。試驗設置6個養(yǎng)殖密度處理組，在相同的水族箱（底面積0.25 m2、水深0.3 m）中分別放養(yǎng)3、5、8、10、13、15尾幼蝦[體長（3.5±0.2） cm，體重（2.4±0.2） g]，每個處理組3個重復，對應養(yǎng)殖密度分別為12、20、32、40、52、60尾/m2（表1）。

1.2.2 飼養(yǎng)方法 試驗用克氏原螯蝦先馴養(yǎng)7 d，待供試蝦適應環(huán)境、生活正常后，挑選健康狀況良好、附肢齊全、大小基本相同的克氏原螯蝦稱重后隨機放入18個水族箱中。各箱隨機排列，并放置適量水草、假山石或帶孔的磚塊供克氏螯原蝦躲避和休息。

試驗期間及馴養(yǎng)期所用飼料為依據克氏原螯蝦幼蝦營養(yǎng)需要而制備的硬顆粒配合飼料（粒徑為1.2 mm）。配方為：魚粉5.0%、豆餅35.0%、菜餅5.0%、棉餅5.0%、次粉35.0%、麥麩5.0%、皮糠5.0%、磷酸氫鈣1.5%，沸石粉2.0%、鹽0.5%、預混料1.0%。試驗用水為曝氣后的自來水。試驗期間水溫為室內自然溫度（21～28 ℃），全天24 h充氣增氧。各處理組分別在每天清晨和傍晚一日兩次投喂等量的飼料并做記錄，投喂量為每箱蝦體重的5%，每周調整一次。每次投喂前1 h吸凈前次糞便和殘飼后再投喂。每3 d換水1次，每次換水1/3，連續(xù)飼養(yǎng)2個月。飼養(yǎng)期結束前1 d禁食，飼養(yǎng)試驗結束時對每箱蝦計數，對每個個體量體長、稱體重，并觀察和記錄附肢是否完整。計算相對增長率、相對增重率、成活率和附肢完整率等指標。

相對增長率=（終均體長-初均體長）/初均體長×100%

相對增重率=（終均體重-初均體重）/初均體重×100%

成活率=成活尾數/總尾數×100%

附肢完整率=附肢完整尾數/總尾數×100%

1.2.3 測定方法 飼養(yǎng)試驗結束后用鑷子小心取出各試驗組蝦的肝胰腺，準確稱取部分組織的質量，加9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取組織勻漿上清液再用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿待測。

克氏原鰲蝦肝胰腺中ACP、T-SOD、LZM的檢測均使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。ACP活力采用酚氧化分光光度法測定，其活力單位定義為：每克組織中蛋白質在37 ℃與基質作用30 min產生1 mg酚為1 U（U/g prot）；T-SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定，其活力單位定義為：每毫克組織中蛋白質在每毫升反應液中T-SOD抑制率達50%時對應T-SOD的量為一個酶活力單位（U/mg prot）；LZM活力測定采用空白對照比濁法測定，LZM含量單位為U/mL；具體測定步驟按照說明書進行。各項指標的計算公式如下：

ACP活力=（測定管吸光度/標準管吸光度）×標準管含酚的量（0.003 mg）/組織中蛋白質含量。

T-SOD活力=（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×反應液總體積/取樣量/組織中蛋白質含量。

LZM活力=（測定管透光度-空白管透光度）/（標準管透光度-空白管透光度）×標準管濃度（2 000 U/mL）×樣本稀釋倍數。

1.2.4 統(tǒng)計方法 試驗數據用ANOVA進行方差分析，Duncan’s進行多重比較。試驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長和成活率的影響

試驗結果（表2）表明，飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長和成活率有顯著影響。由表2可見，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，平均每尾蝦的相對增長率、相對增重率和成活率均呈下降趨勢。在飼養(yǎng)密度為12尾/m2和20尾/m2時，相對增長率和相對增重率均較大，2組間沒有顯著差異，成活率均為100%。當飼養(yǎng)密度達到及超過32尾/m2時，其相對增長率和相對增重率均顯著降低，成活率也顯著下降。當飼養(yǎng)密度達到及超過52尾/m2時，附肢完整率也顯著下降。

2.2 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦肝胰腺三種免疫酶活性的影響

飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦肝胰腺ACP、T-SOD和LZM活性的影響見表3。由表3可見，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，其肝胰腺ACP、T-SOD、LZM活性均呈下降趨勢。在飼養(yǎng)密度為12尾/m2時，3種免疫酶的活性均為最大。當飼養(yǎng)密度達到20尾/m2時，ACP活性開始顯著下降，T-SOD和LZM活性雖有下降趨勢，但與Ⅰ組（密度12尾/m2組）相比差異不顯著；當飼養(yǎng)密度達到及超過32尾/m2時，3種免疫酶的活性均顯著降低。

3 討論

3.1 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長和死亡率的影響

本試驗結果表明，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，其相對生長率（相對增長率、相對增重率）和成活率均顯著下降。這與嚴維輝等[3]對克氏原螯蝦成蝦的研究結果一致，即隨著飼養(yǎng)密度的增大，克氏原螯蝦的單位產量、回捕率會下降，收獲規(guī)格（尾均重）會減小。劉國興等[4]研究結果表明，高密度養(yǎng)殖會使克氏原螯蝦飼料系數、殘肢率升高，生長率降低，水質（總氮、總磷、氨氮、亞硝酸鹽氮升高）惡化。隨著個體的生長及種群密度的增大，引起死亡率增高的原因固然有水體環(huán)境質量下降、食物得率降低的原因，但在實驗室飼養(yǎng)條件下（如本次試驗中，24 h充氣增氧、每3 d換水一次、每天按體重的5%投喂）這方面應該不會是主要因素?？耸显r是一種領地意識極強的蝦類。嚴維輝等[5]對克氏原螯蝦不同放養(yǎng)密度下殘殺情況的試驗結果表明，隨著飼養(yǎng)密度的升高，克氏原螯蝦種群內互相殘殺情況越嚴重，死亡率也就越高，種群增長量則呈下降趨勢。就本試驗過程中所觀察到的實際情況和收獲時對存活蝦所統(tǒng)計的附肢完整率都真實、準確地證實了這一點。由此可見，克氏原螯蝦種群內斗爭還表現在對生存空間和領地的爭奪，為此種群內不惜互相殘殺，而且隨著飼養(yǎng)密度的增大其爭斗越嚴重。這應該是克氏原螯蝦隨著飼養(yǎng)密度的增大其相對生長率和成活率均呈顯著下降趨勢的重要因素。

3.2 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦肝胰腺三種免疫酶活力的影響

甲殼類動物無特異性免疫系統(tǒng)，以非特異性免疫為主，溶菌酶（LZM）是吞噬細胞殺菌的物質基礎，具有機體防御的功能，在動物免疫研究中，溶菌酶活性是衡量動物體非特異性免疫的一個重要指標[6]。酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、淋巴液中的酚氧化酶原系統(tǒng)（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、凝集素等是其機體中重要的免疫因子，以不同的方式抵御病原體的侵襲[7]，SOD是蝦體內活性氧防御體系的重要組成部分，LZM、ACP的活性程度可以大體反映機體的免疫機能狀況[8]。周俊芳等[9]對凡納濱對蝦的研究表明，集約化養(yǎng)殖模式下的高密度因素對WSSV感染與疾病暴發(fā)起促進作用。在本試驗中沒有對死亡蝦體進行疾病的診斷和鑒定，但本試驗對各組蝦體內的部分免疫酶活力進行了測定。結果表明，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，其肝胰腺ACP、T-SOD、LZM活性均呈顯著下降趨勢，說明隨著飼養(yǎng)密度的增大，克氏原螯蝦機體的免疫力也在呈顯著下降趨勢，這可能也是隨著飼養(yǎng)密度的增大，克氏原螯蝦死亡率逐漸升高、成活率逐漸降低的另一個原因。

3.3 克氏原螯蝦適宜的飼養(yǎng)密度

適宜密度應該是既能充分利用水體資源又能避免克氏原螯蝦種群內互相殘殺現象發(fā)生，從而最大限度地發(fā)揮其生長潛能、提高其成活率的飼養(yǎng)密度。當然，適宜的飼養(yǎng)密度也應該充分考慮到投放規(guī)格的大小。從本試驗結果看，克氏原螯蝦[體重（2.4±0.2） g]的適宜養(yǎng)殖密度應該為20尾/m2左右。本試驗結果表明，飼養(yǎng)密度在這個水平時克氏原螯蝦的相對生長率、成活率和機體的免疫水平均較高，與12尾/m2的飼養(yǎng)密度水平差異不顯著；而當飼養(yǎng)密度達到32尾/m2及以上時，克氏原螯蝦的相對生長率、成活率和機體的免疫水平均顯著下降；所以克氏原螯蝦[體重（2.4±0.2） g]的適宜養(yǎng)殖密度為20尾/m2左右。養(yǎng)殖實踐證明，采用適宜的養(yǎng)殖密度是降低成本、增加效益的有效途徑，也是維持漁業(yè)水域生態(tài)環(huán)境平衡和穩(wěn)定、保持水產養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展的前提條件[10]。

4 小結

在本試驗設置的養(yǎng)殖密度梯度范圍內，隨著密度的增加，克氏原螯蝦的相對生長率、成活率、附肢完整率及肝胰腺中的ACP、T-SOD、LZM活性均呈顯著下降趨勢?？紤]到既要能充分利用水體資源又要獲得最大的生長率和成活率，綜合分析后認為，20尾/m2的飼養(yǎng)密度為此規(guī)格克氏原螯蝦適宜的飼養(yǎng)密度。

參考文獻：

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