珍稀瀕危植物寶華玉蘭ISSR—PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化

摘要：為建立和優(yōu)化寶華玉蘭（Magnolia zenii Cheng）ISSR-PCR反應(yīng)體系，采用正交試驗和單因子試驗方法對影響PCR擴增體系中的Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定濃度的用量5個因子進行分析比較。結(jié)果顯示，寶華玉蘭ISSR-PCR 25 μL反應(yīng)體系中的5個因子最佳水平分別為DNA模板（20 ng/μL） 3.5 μL，引物（10 μmol /L） 1.25 μL，Taq聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 0.8 μL。寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系建立，為進一步利用ISSR對其進行分子標記輔助育種、分子身份證構(gòu)建和遺傳多樣性分析等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：寶華玉蘭（Magnolia zenii Cheng）；ISSR-PCR反應(yīng)體系；種質(zhì)資源保護

中圖分類號：Q949.747.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4206-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.034

寶華玉蘭（Magnolia zenii Cheng）是木蘭科（Magnoliaceae）珍貴園林觀賞植物，在每年的3～4月開花，其芳香艷麗、姿態(tài)優(yōu)美，有極高的觀賞價值。但其僅產(chǎn)自江蘇省句容縣寶華山，數(shù)量較少，已被列為國家二級重點保護植物。由于寶華玉蘭產(chǎn)地單一，對于環(huán)境的要求特別嚴格，所以人工栽培并成功的事例很少，同時由于林下灌木層不斷被破壞，沒有更新苗木，現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài)[1]。面對如此嚴峻的形勢，開展對寶華玉蘭的遺傳多樣性分析研究、制定具有針對性的種質(zhì)資源保護策略刻不容緩。簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性（Inter-simple sequence repeats，ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種分子標記技術(shù)[2]，ISSR分子標記技術(shù)兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優(yōu)點，與其他技術(shù)相比，ISSR不需要預(yù)先獲知序列信息而使成本降低，且多態(tài)性更豐富；并且重復(fù)性高、穩(wěn)定性好，同時具備簡便、易操作等特點；相比之下，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高[3]。由于上述優(yōu)點，ISSR在植物種質(zhì)資源研究尤其是種質(zhì)資源的收集和鑒定、遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒別及基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用[4-9]。

目前對寶華玉蘭的研究，僅在形態(tài)學(xué)、生物生態(tài)學(xué)特性、生存現(xiàn)狀、文獻考證、群落學(xué)分析等方面有過初步研究和探索，對該物種在分子水平上的遺傳多樣性分析至今尚未見報道。試驗通過正交試驗和單因子試驗，分析DNA模板、Taq聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs 5個因子用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響，建立寶華玉蘭最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系，以期為利用ISSR標記對其進行分子標記輔助育種、分子身份證構(gòu)建和遺傳多樣性分析等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所需的寶華玉蘭活體材料采自江蘇省句容縣寶華山。采取植物葉片后用硅膠快速干燥，妥善保存后送回南京森林警察學(xué)院實驗室。

1.2 方法

1.2.1 寶華玉蘭DNA提取 取硅膠干燥的植物葉片0.1 g，用研缽研磨粉碎，采用改良的十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法抽提基因組DNA[10]。DNA的濃度和質(zhì)量采用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

1.2.2 寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)引物篩選 引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）網(wǎng)站公布的第九套ISSR引物序列進行合成。從100個ISSR引物中隨機選擇12條引物803、816、826、834、842、848、857、863、875、886、890、897進行目標引物的篩選。初反應(yīng)體系為25 μL，其中Taq聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2 μL，DNA模板（20 ng/μL） 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL，引物（10 μmol/L） 1 μL，MilliQ水15.3 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產(chǎn)物檢測。

1.2.3 寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系建立 對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的5因素（Taq酶、Mg2+、DNA模板、dNTPs、引物）4水平（濃度）設(shè)置正交試驗L16（45），共16個處理，每處理重復(fù)2次，建立寶華玉蘭 ISSR-PCR反應(yīng)體系，具體信息見表1和表2。

1.2.4 寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)單因子試驗設(shè)計 對正交試驗建立的ISSR-PCR反應(yīng)體系進行單因子試驗（Mg2+、DNA模板、dNTPs、引物及Taq酶用量），分析不同因素對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響；各單因子處理設(shè)置具體信息見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標引物確定

綜合比較電泳條帶的多態(tài)性、穩(wěn)定性以及亮度，12條隨機引物2次重復(fù)的ISSR-PCR擴增電泳結(jié)果見圖1。從圖1可見，在12條引物中，以引物834的效果最好。故引物834被選定為目標引物進行正交試驗并建立寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系。

2.2 寶華玉蘭ISSR-PCR正交試驗

基于引物834的寶華玉蘭ISSR-PCR 5因素4水平正交試驗結(jié)果見圖2。從圖2可見，16個處理中除12、13號處理無法擴增出條帶外，其他處理均能擴增出條帶，且每個處理重復(fù)效果基本一致。對有擴增結(jié)果的14個處理進行進一步比較，發(fā)現(xiàn)處理7的條帶最清晰，并且處理7的條帶多態(tài)性較好，故選取處理7對寶華玉蘭進行ISSR-PCR反應(yīng)體系單因子試驗，分析不同因素對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響，處理7的25 μL反應(yīng)體系中：DNA模板（20 ng/μL）2.0 μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L）0.75 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.4 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL。據(jù)此，對該體系進行單因子試驗濃度梯度設(shè)計（表2），并進行相應(yīng)的 ISSR-PCR反應(yīng)。

2.3 寶華玉蘭ISSR-PCR單因子試驗

圖3為不同DNA模板、引物、dNTPs、Mg2+濃度及Taq聚合酶用量單因子試驗對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響。

2.3.1 DNA模板用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 最佳DNA模板用量取決于物種基因組大小及DNA模板的純度。試驗比較了25 μL反應(yīng)體系中DNA模板（20 ng/μL）4個用量0.5、2.0、3.5、5.0 μL的效果，發(fā)現(xiàn)在正常情況下，隨著用量的增加，條帶亮度增加，擴增條帶多態(tài)性增強。因此寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系中DNA模板（20 ng/μL）的用量在0.5～5.0 μL范圍時，以3.5 μL用量效果最佳。

2.3.2 引物用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響引物用量會直接影響PCR結(jié)果的可靠性。用量偏大會引起錯配和非特異性擴增，且會增加引物二聚體的形成概率；用量過小則無法檢測出所有的ISSR位點。試驗引物用量（10 μmol/L）設(shè)置了0.25、0.75、1.25、1.75 μL 4個水平，結(jié)果表明（圖3），引物用量在1.25 μL時條帶最多且清晰，所以引物用量1.25 μL（10 μmol/L）是寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的最適用量。

2.3.3 dNTPs用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響 dNTPs是ISSR-PCR反應(yīng)的原料，用量過高，會導(dǎo)致PCR錯配，出現(xiàn)非特異性擴增條帶；反之則影響合成效率，甚至?xí)蜻^早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴增效果。試驗dNTPs用量（2.5 mmol/L）設(shè)置了0.8、1.4、2.0、2.6 μL 4個水平，結(jié)果（圖3）表明，在dNTPs用量為0.8 μL時，擴增條帶亮度和多態(tài)性最好，故寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系中dNTPs最佳用量為0.8 μL（2.5 mmol/L）。

2.3.4 Mg2+用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響 Mg2+用量對PCR擴增特異性和產(chǎn)物有顯著的影響。比較寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系中0.4、1.2、2.0、2.8 μL（25 mmol/L） 4個Mg2+用量的電泳結(jié)果，當Mg2+用量為2.0 μL時，條帶多態(tài)性較豐富。因此寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系中最適合的Mg2+用量應(yīng)為2.0 μL（25 mmol/L）。

2.3.5 Taq聚合酶用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)的影響 Taq聚合酶用量直接影響擴增反應(yīng)的成功與否，但Taq酶用量多不僅成本高，而且易產(chǎn)生非特異擴增產(chǎn)物；但如若Taq酶用量過低，則會導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降。由圖3可見，Taq酶用量在0.05～0.50 μL（5 U/μL）范圍時，以0.20 μL用量效果最好，條帶最亮、多態(tài)性最豐富。

3 討論

ISSR是一種基于PCR的分子標記技術(shù)，而影響PCR反應(yīng)的因素有多種，其中DNA是PCR反應(yīng)的模板，dNTPs是PCR反應(yīng)的原材料，引物與DNA靶序列結(jié)合引導(dǎo)PCR反應(yīng)，Mg2+是Taq聚合酶的激活劑。因此，ISSR-PCR反應(yīng)體系受DNA模板、dNTPs、引物、Mg2+和Taq聚合酶等因素及因素間相互作用的影響；不同反應(yīng)體系中各因素水平的組合不同，也就產(chǎn)生了不同的ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果[11-13]。為此，試驗采用正交試驗L16（45）及單因子試驗找出了各因素水平間的最優(yōu)組合，并確定其為最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明，DNA模板、Mg2+、dNTPs及引物的用量對寶華玉蘭ISSR-PCR擴增的影響較大，濃度過高或過低時常導(dǎo)致背景彌散或條帶缺失；而Taq聚合酶用量對擴增的影響較小，在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)條帶變化不大。

寶華玉蘭ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立為利用ISSR標記對其實施進一步的分子標記輔助育種、DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 薛曉明，闞芯蕊，張 晶. 江蘇省特有植物寶華玉蘭的瀕危狀態(tài)及其保護對策研究[J]. 科技情報開發(fā)與經(jīng)濟，2010，20（35）：137-139.

[2] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR） anchored polymerase chain reaction amplifi cation[J].Genomics，1994，20：176-183.

[3] 樸紅梅，李萬良，穆 楠，等. ISSR標記的研究與應(yīng)用[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，32（5）：28-30.

[4] CAI Y，SUN D K，WU G J，et al. ISSR-based genetic diversity of Jatropha curcas germplasm in China[J]. Biomass and Bioenergy，2010，34：1739-1750.

[5] ARIF M，ZAIDI N W，SINGH Y P，et al. A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in shisham（Dalbergia sissoo）[J].Plant Molecular Biology Reporter，2009，27：488-495.

[6] PARSAEIAN M，MIRLOHI A，SAEIDI G. Study of genetic variation in sesame（Sesamum indicum L.） using agro-morphological traits and ISSR markers[J]. Genetika，2011，47：359-367.

[7] XIE Y，LI J Y，F(xiàn)AN Z Q，et al. DNA extraction and ISSR primer screening of Camellia chekiangoleosa[J]. Agricultural Science Technology，2011，12：825-828.

[8] YE Y M，ZHANG J W，NING G G，et al. A comparative analysis of the genetic diversity between inbred lines of Zinnia elegant using morphological traits and RAPD and ISSR markers[J].Sciatica Horticulture，2008，118：1-7.

[9] LU J J，ZHAO H Y，SUO N N，et al. Genetic linkage maps of Dendrobium moniliforme and D. officinale based on EST-SSR，SRAP，ISSR and RAPD markers[J].Scientia Horticulturae，2012， 137：1-10.

[10] 李金璐，王 碩，于 婧，等.一種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報，2013，48（1）：72-78.

[11] 王弦云，朱曉敏，王 勤，等. 杜仲ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與引物篩選及其在遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 經(jīng)濟林研究，2013，31（1）：30-34.

[12] 田 斌，辛培堯，孫正海，等. 三七ISSR-PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，28（1）：96-101.

[13] 胡鳳榮，王 斐，王志強，等. 風(fēng)信子ISSR-PCR體系的優(yōu)化及引物篩選[J]. 分子植物育種，2013，11（1）：139-144.